電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

本手順の全体的な目的は、電気や研究室の設備を必要とせずに、サンプルからPCR可能な核酸および免疫反応性タンパク質を単離することです。核酸とタンパク質の単離は、サンプルにグアニジンおよびチオシアネートを混ぜてサンプルを溶菌させ、その混合液を抽出ピペット内の吸着剤に通すことから始まります。吸着剤への5回目の最終的な通過後、混合液をタンパク質抽出バッファーに入れ、免疫反応性タンパク質を単離するために静置します。

次に、95%ethanolを吸着剤に通して、吸着剤と結合した核酸を洗浄します。その後、吸着剤に外気を5分間通す操作を数回繰り返し、吸着剤と結合した核酸を乾燥させます。PCR readyな核酸抽出の最終ステップは、250 µLのtrisまたは同様の別の水溶液を用いて、免疫反応性タンパク質の単離のために吸着剤から核酸を溶出させることです。

サンプルとタンパク質抽出バッファーを混合した後、2本目の抽出用ピペットを使用し、混合液を吸着剤に通す操作を15回繰り返します。次のステップでは、95% ethanolを吸着剤に繰り返し通すことで、タンパク質が結合した吸着剤を洗浄します。その後、吸着剤に外気を5分間通して、吸着剤と結合したタンパク質を乾燥させます。

プロトコルの最終ステップは、吸着剤からタンパク質を溶出させることです。最終的に、本手順で使用される抽出ピペットにより、電気を必要とせずにPCR準備完了の状態の核酸および免疫反応性タンパク質を単離することが可能になります。こんにちは、デーブ・パウォルスキーです。

私はニューヨーク州バッファローにあるKubrick Incorporatedのシニアリサーチサイエンティストです。本日は、遠心分離機やボルテックスミキサー、その他の余分な実験器具を必要とせずに、タンパク質と核酸の両方をインラインで単離する手法について学びます。サンプルの溶解を行う前に、サンプルが液体状態であることを確認してください。食品や糞便など、サンプルが固形である場合は、水やリン酸緩衝生理食塩水などの液体培地に懸濁させてください。

1.5 mLチューブ内で、サンプル500 µLと6 Mグアニジンチオシアネート500 µLを混合します。次に、抽出ピペットのバルブを押し、中の空気を排出します。バルブをゆっくりと膨張させ、吸着材を介して1 mLのサンプル全体を抽出ピペット内に吸い上げます。

抽出ツールを反転させ、吸着ビーズとサンプルがバルブに流れ込むようにします。バルブ内でサンプルと共に吸着ビーズを粉砕します。この際、サンプルが抽出ピペットから排出されないよう注意してください。

抽出ピペットを逆さまにし、サンプルを元の1.5 milliliterチューブに戻します。1 milliliterのサンプル全体を抽出ピペットに吸い込み、適度な速度で吸着剤を通過させます。吸着剤が抽出ピペットのネック部分に留まるように注意しながら、バルブを押し、サンプル全体を1.5 milliliterチューブに排出します。

この工程を繰り返し、サンプルを吸着剤にさらに4回通過させ、合計5回通過させます。5回目の通過後、1 mLのサンプル全量を、15 mLコニカルチューブに入れた4 mLのタンパク質抽出バッファー中に排出します。チューブを転倒混和し、蓋を閉めて後で使用するまで置いておきます。

95% ethanol 1 mLを吸着剤に通して分離した核酸を洗浄し、この操作を3回繰り返します。その際、エタノールは元のチューブに戻してください。最後の洗浄後、別の95% ethanol 1 mLを用いて、さらに3回洗浄を繰り返します。手順の次のステップは吸着剤を乾燥させることです。吸着剤が乾燥している状態で、核酸の回収効率が最大になります。

この工程は手間がかかる作業ですが、推奨される時間通りに完了させることで、より良好な結果を得ることができます。バルブを5分間、押しては離す動作を繰り返してください。

抽出ピペットに周囲の空気を流して核酸と吸着剤ベッドを乾燥させ、抽出ピペットの先端に残っているエタノールを拭き取ります。キムワイプを使用し、10 mM Trisを250 µLずつ5回吸着剤に通過させて核酸を回収します。Tris緩衝液は、PBSなどの他の適切な水溶液で代用可能です。

得られた溶液には抽出された核酸が含まれています。まずタンパク質抽出を行うため、あらかじめ準備しておいたタンパク質抽出バッファーにサンプルを混ぜ、チューブを反転させます。この5 mLのサンプルのうち、約2〜3 mLを新しい抽出ピペットの吸着剤の上に通します。吸着剤が抽出ピペットのネック部分にとどまるように注意しながら、サンプル全体を同じ15 mLコニカルチューブの中にピペッティングで排出してください。

この工程を繰り返し、サンプルを吸着剤に15回通過させます。1 mLの95%Ethanolを吸着剤ベッドに3回通過させ、そのエタノールを元のチューブに排出することで、吸着剤と結合したタンパク質を洗浄します。さらに、別の1 mLの95%ethanol洗浄液を用いて、あと3回洗浄します。

手順の次のステップは、吸着剤を再度乾燥させることです。核酸と同様に、吸着剤をより長い時間乾燥させた状態でタンパク質を回収するのが最適です。

バルブを5分間押し、離す動作を繰り返し、抽出ピペット全体に外気を通します。タンパク質吸着剤ベッドを乾燥させるため、抽出ピペットの先端から残留エタノールを拭き取ります。キムワイプを使用して、250 µLのPBSを吸着剤に5回通し、タンパク質を回収します。

PBSバッファーは、10 millimolar tris (pH 6.8) など、他の適切な水溶液で代用可能です。得られた溶液にはサンプルのタンパク質含有量が含まれています。抽出ピペットを用いた核酸タンパク質抽出手順により、腸管出血性大腸菌 O157:H7 EDL933株に関連する志賀毒素遺伝子を増幅させました。

シガトキシン遺伝子であるShiga toxin oneおよびshiga toxin twoは、PRプロモーターの制御下にある温和なラムダ様バクテリオファージおよび欠損バクテリオファージ上に存在します。E. coliにおけるSOS応答の活性化は、プロファージの誘導および／または毒素の産生を引き起こします。本例では、未処理のコントロールと比較して、mitomycin CによってSOS応答が誘導された際に、sugar toxin two遺伝子の増幅が大幅に増加します。

これはプロファージの誘導およびファージゲノムの複製を示唆しています。ビデオで説明した核酸・タンパク質分離実験から回収されたタンパク質は免疫反応性を示しました。単離されたタンパク質分画をRapid Check E. coli O157ラテラルフローアッセイストリップに適用しました。

コントロールでは、シガ毒素の誘導の有無にかかわらず、E. coli O157を保有するすべてのサンプルにおいて、2本の赤色のバンドの出現により陽性判定が示されました。また、抽出ピペットを用いて核酸およびタンパク質の処理を行ったE. coli O157保有サンプルにおいても、陽性の結果が示されました。これらのデータは、各サンプルから単離されたタンパク質が免疫活性を有しており、陽性反応を誘発したことを示しています。

単離したタンパク質は、6 Mのグイジンイソチオシアネートから単離したBSAをロードし、クマシー染色を施した8%アクリルアミドゲルで示すように、電気泳動に適しています。この抽出法、ピペット操作および関連プロトコルを用いることで、単離したタンパク質の電気泳動移動度はコントロールサンプルと同一になります。習得すれば、この手法を20分以内に完了させることができます。

このビデオを視聴することで、シンプルなデバイスからタンパク質および核酸を単離する方法について明確に理解できたはずです。本ビデオをご視聴いただき、ありがとうございました。