網膜ミクログリアの貪食機能を評価しますインビボフローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました
2016年10月18日
組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。
この手順の全体的な目標は、in vivo で網膜ミクログリアの食作用機能を評価することです。この方法は、特定の化合物が生理学的環境でミクログリアの食作用機能を変化させるかどうかなど、眼科分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーを使用しているため、ミクログリア食作用の迅速かつ正確な定量分析が可能になることです。
この手順のデモンストレーションを手伝ってくれるのは、私の研究室のポスドクである崎本進です。まず、33ゲージの針とシリンジに0.5マイクロリットルの蛍光標識粒子溶液を装填します。次に、麻酔をかけたマウスを手術用顕微鏡で柔らかい材料の上に横向きに置き、つま先のつま先をつまむことに反応しないことで適切な鎮静レベルを確認します。
次に、鉗子を使って片方のまぶたの周りに慎重に圧力をかけ、眼球がソケットからわずかに飛び出すようにします。次に、耳のすぐ上と動物の顎のそばにある2本の指で頭をつかみ、まぶたと平行に皮膚をそっと伸ばして、目がソケットからわずかに膨らむようにします。硝子体内注射は困難であり、正しく行わないと偏りのある変動する結果につながります。
目への外傷を減らすために、頭の動きを最小限に抑えて動物を安定した位置に保持します。眼球に穴を開けるには、片手でマウスをそっとつかみます。次に、角膜と強膜が接続する角膜辺縁部を見つけます(色素沈着マウスでは灰色の円として見えます)。
もう一方の手でシリンジを持って、針をリンバスに挿入します。次に、針を少し引っ込めて少量の硝子体液を排出し、プランジャーをゆっくりと押し下げて粒子を注入します。すべてのビーズが送達されたら、注射器をゆっくりと引き抜いて注入された材料の逆流を防ぎ、目が元の位置に戻ったら、保湿液を塗布して目の水分を保ちます。
次に、動物を完全に回復するまで監視しながら、動物を自分のケージの加熱パッドに置きます。硝子体内注射の3時間後、45度の角度の鉗子を使用してまぶたを優しく押し、眼球を支えます。鉗子を眼球の後ろに置き、引っ張ります。
次に、眼球をシャーレの乾燥領域に移し、少量のPBSとカルシウムとマグネシウムを含ませたものを解剖顕微鏡で観察します。そして、極細鉗子の先端を1本使用して、角膜輪部に眼を穿孔します。次に、45度の角度の細かい鉗子で眼球を保持し、スプリングハサミを使用して角膜辺縁部の周りを円周の約半分が切断されるまで切断します。
眼球をPBSに移し、2組目の細い45度の角度の鉗子を使用して角膜と強膜を引き裂きます。レンズと網膜は無傷で出てきます。レンズと網膜が分離されていることを確認し、網膜をカルシウムとマグネシウムを含む2ミリリットルのPBSを含む5.4ミリリットルのポリスチレン試験管に移します。
網膜細胞の単一細胞懸濁液を得るには、製造元の指示に従ってニューロン組織解離キットを使用し、細胞を200マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁します。次に、サンプルを96ウェルU底プレートの1つのウェルに移します。遠心分離後、プレートを反転させて上清を廃棄し、室温で5分間、ウェルあたりCD16、CD32抗体を含む25マイクロリットルの染色緩衝液でFC受容体をブロックします。
次に、目的の抗体で細胞を標識し、室温の暗所で15分間。次に、細胞をペレット化し、これに続いてウェルあたり200マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液で洗浄します。次に、ペレットを200マイクロリットルの染色緩衝液と生存率染料に再懸濁し、サンプルを1.2ミリリットルのマイクロタイターチューブに移します。
次に、さらに100マイクロリットルの染色バッファーと生存率色素でウェルを洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のために対応するサンプルと洗浄液をプールします。この方法は、出生後10〜20日齢のマウスまたは成体マウスに使用でき、化合物の影響および/またはミクログリア食作用の遺伝子操作をテストするために適合させることができます。たとえば、さまざまな用量の LPS を使用した腹腔内チャレンジ後のこの実験では、1 キログラムあたり 1.42 ミリグラムの LPS 用量で、ビヒクル チャレンジ コントロールと比較して、食作用性ミクログリアの割合が統計的に有意に増加することが決定されました。
このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で完了することができます。この手順に続いて、細胞ソーティングとそれに続くqPCRまたはプロテオミクス分析などの他の方法を使用して、網膜の食作用性ミクログリアと非食作用性ミクログリアの違いに関するさらなる質問に答えることができます。この技術を開発することで、視覚科学者や神経科学者が、その場で生理学的に重要な状況でミクログリアの食作用機能をさらに探求することを可能にする
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概要
本記事では、網膜ミクログリアの食作用をin vivoで評価するための新しい手法を紹介します。フローサイトメトリーを利用することで、組織の恒常性と病理を理解する上で不可欠な、ミクログリアの食作用の迅速かつ精密な定量分析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 眼科学
- 細胞生物学
背景
- ミクログリアの食作用は、組織の恒常性を維持するために不可欠です。
- 食作用機能の不全は、さまざまな病理学的状態に関連しています。
- in vivoでミクログリアの機能を評価することは、技術的な課題を伴います。
- フローサイトメトリーは、分析のための堅牢な手法を提供します。
研究の目的
- 生理的条件下における網膜ミクログリアの貪食能を評価すること。
- 特定の化合物がミクログリアの貪食に及ぼす影響を明らかにすること。
- 眼科学における今後の研究に向けた信頼性の高い手法を提供すること。
使用した手法
- 蛍光標識粒子溶液を33ゲージの針に充填します。
- 手術用顕微鏡を用いて精密な観察を行います。
- 麻酔下にあるマウスをモニタリングし、適切に鎮静されていることを確認します。
- 定量的解析のためにフローサイトメトリーを用います。
主な結果
- この手法により、ミクログリアの phagocytosis を正確に測定することが可能になります。
- フローサイトメトリーを用いることで、従来の方法に比べて迅速に結果を得ることができます。
- 化合物の phagocytic 機能に対する潜在的な影響を評価できます。
- この方法は、健康時および疾患時におけるミクログリアの役割の理解を深めます。
結論
- 開発された本手法は、ミクログリア機能の研究における重要な進展である。
- これにより、神経炎症および網膜の健康に関する研究に新たな道が開かれる。
- 今後の研究において、この手法を活用することで治療的介入の探索が可能となる。
よくある質問
業界における実用的意義
フローサイトメトリーを用いた網膜マイクログリアの食細胞機能の定量的評価は、神経炎症および神経変性疾患のパイプラインにおけるCNSターゲットの検証およびメカニズム的なリスク低減における重要な課題を解決します。このアプローチにより、生理学的に関連のある環境下でマイクログリア活性の精密かつ再現性のある測定が可能となり、初期探索およびトランスレーショナル研究における予測の信頼性が向上します。本手法の適応性と迅速性は、CNSおよび眼科プログラムにおける堅牢な化合物評価およびポートフォリオの選別を促進します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 標的バリデーションのため、生体内でミクログリアの食作用機能を直接的に解析することを可能にします。
- 遺伝学的または薬理学的摂動に対する機能的反応を定量化することで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 定量的なリードアウトを提供することで、CNSおよび網膜疾患モデルにおける予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 下流の化合物スクリーニングに向けた、バリデーション済みの生理学的関連性を持つミクログリアシステムを構築します。
- フローサイトメトリーにより、標準化され再現性のある定量的な食作用測定を実現します。
- ミクログリア機能に対する化合物の影響を迅速に評価でき、拡張可能なスクリーニングワークフローを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 神経変性疾患および網膜疾患におけるトランスレーショナルなバイオマーカー開発に向けた、疾患関連モデルとの整合性を確保します。
- in vivo機能アッセイを可能にすることで、探索から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 定量的なミクログリア活性データに基づいた、リスク調整後の進展判断をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このフローサイトメトリーを用いたアッセイは、創薬から前臨床段階への連続的なプロセスに組み込まれており、CNS（中枢神経系）および眼科領域のパイプラインにおける仮説検証、化合物スクリーニング、およびトランスレーショナルリサーチを可能にします。
- 探索生物学：マイクログリアの食作用を定量化し、経路の機能を明らかにし、生物学的仮説のリスクを軽減します。
- スクリーニング：検証済みのin vivoシステムにおいて、化合物評価のための再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：実験条件や化合物の効果を比較するための、統計的に堅牢な測定値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連モデルにおける機能的バイオマーカーの整合を可能にすることで、探索研究と前臨床研究を橋渡しします。
- エンタープライズ再利用：さまざまなCNS（中枢神経系）および網膜研究のアプリケーションに適応可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： マイクログリアのターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値： チーム間で利用可能な、標準化された迅速かつスケーラブルな食作用アッセイを提供します。
- 戦略的価値： パイプラインの早期段階で堅牢な機能データを提供することで、go/no-go決定の精度と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： CNS（中枢神経系）および眼科領域のアセットにおいて、リスク調整後の優先順位付けと開発推進を可能にします。
実施上の留意点
- げっ歯類の眼科的手技およびフローサイトメトリー解析に関する専門知識が必要です。
- 手術用顕微鏡、フローサイトメーター、および検証済みの抗体パネルへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、注射および解析プロトコルのチーム間での標準化が不可欠です。
- プロトコルの最適化により、異なる年齢のげっ歯類や、他のCNS組織への適応が可能です。
- ばらつきとバイアスを最小限に抑えるため、精密な硝子体注射技術に依存します。
