で水平遺伝子伝達の研究のための方法論黄色ブドウ球菌

この手順の全体的な目標は、3つの主要な伝達経路に対処することにより、黄色ブドウ球菌のDNAの水平伝播を研究するための詳細な方法論を提供することです。コンジュゲーション、形質導入、および自然な形質転換。この方法は、ヒト病原体黄色ブドウ球菌における抗生物質耐性遺伝子の水平移動に関するものです。

ここで紹介する技術の主な利点は、最近発見された自然な遺伝的形質転換を含む、3つの主要な移行モードをテストできることです。実験を開始するには、トリプシン大豆ブロスにドナーとレシピエントの細菌を5ミリリットルの一晩培養します。または、クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムの有無にかかわらず、TSB培地。

摂氏37度で振る。翌日、一晩培養した光学濃度を新鮮なTSB培地で光学濃度に調整します。0.5ミリリットルのドナー培養物と0.5ミリリットルのレシピエント培養

そして、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水、またはPBSを混合物に加えます。次に、真空ポンプシステムを使用して、細菌の混合物を0.45マイクロメートルのフィルター膜に移します。フィルターメンブレンを羊の血液寒天プレートに置きます。

プレートを摂氏37度で1日インキュベートします。プレートからフィルター膜を取り出し、10ミリリットルのPBSに懸濁します。混合物を約1分間ボルテックスして、メンブレンに付着したすべてのバクテリアを収集します。

細菌懸濁液を新鮮なTSBで連続10倍希釈します。TSB寒天上に0、10、4希釈サンプルの100マイクロリットルをプレートします。または、トランスコンジュガントを選択するために、クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムとテトラサイクリン1リットルあたり8ミリグラムを補充したTSAプレート。

希釈した懸濁液100マイクロリットルをTSAプレートにプレート化し、テトラサイクリンのみで1リットルあたり8ミリグラムでプレート化します。受信者の総数をカウントします。インキュベーション後、コロニーPCRによるCFR遺伝子の存在とその感受性プロファイルについて、二重耐性コロニーを分析します。

標準的な微量希釈法または椎間板拡散法に従って、適切な抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を測定することにより、アンチバイオグラムを決定します。トランスコンジュガントの感受性プロファイルは、レシピエントと同一でなければなりません。ただし、クロラムフェニコールやCFR遺伝子の影響を受ける他の化合物は除きます。

ドナー株によって発症したテトラサイクリン耐性を除外すること。3.6ミリモルのカルシウムを補給した5ミリリットルの栄養ブロスでN315-45の一晩培養を準備します。一晩の培養物を50ミリリットルのガラスバイアルで10ミリリットルの最終容量で1,000に希釈することにより、継代培養を準備します。

摂氏37度で1時間、1分間に180回転を振ってバクテリアを増殖させます。次に、NB塩化カルシウム培地で希釈したファージMR83aのシリーズを調製します。希釈したファージを20マイクロリットルを細菌培養物に加えます。

ファージ感染のないコントロール培養物を調製し、細菌細胞増殖のポジティブコントロールとして機能します。次に、毎分100回転で一晩中穏やかに振とうしながら、摂氏37度で培養物を成長させます。翌日、添加したファージの希釈度が最も高い透明化した培養バイアルを1つまたは2つ選択します。

培養物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。チューブに250マイクロリットルのクロロホルムを加え、それらを反転させて培養物を完全に混合します。培養物をGの5, 000倍で4°Cで20分間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移し、使用するまで摂氏4度で保管します。.栄養スープ寒天培地を準備し、摂氏55度の水浴で保温します。オートクレーブ処理した0.5モルの塩化カルシウム溶液を培地に加え、最終濃度3.6ミリモルにします。

90ミリメートルのシャーレNB塩化カルシウムプレートに注ぎます。5ミリリットルのNB塩化カルシウムにN315を37°Cで振とうしながら一晩培養します。翌日、10マイクロリットルのオーバーナイト培養物を200マイクロリットルのNB塩化カルシウムに加え、NB塩化カルシウムプレートに均等に広げます。

プレートの表面が液体で覆われている場合は、広がりを止めます。その後、プレートを5分間乾かします。NB塩化カルシウム培地を使用して、以前に調製したファージの1〜10希釈を連続して行います。

各ファージ希釈液の3マイクロリットルを、バクテリアで覆われたプレートにスポットします。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。翌朝、プラーク番号を数え、次の式を使用してファージ力価を計算します。

N315、COL、またはMU50を、摂氏37度の5ミリリットルのNB塩化カルシウムに一晩培養し、毎分180回転で振とうします。一晩培養した後、NB塩化カルシウムでファージを109 PFU/mLに希釈します。50ミリリットルのガラスバイアルに、500マイクロリットルの一晩培養、500マイクロリットルの新鮮なNB塩化カルシウム、および1ミリリットルのファージ109PFU/1ミリリットルを混合します。

混合物を摂氏37度でインキュベートし、毎分100回転で30分間穏やかに振とうします。インキュベーション後、50マイクロリットルの20%クエン酸三ナトリウムを培養物に加えます。37°Cで30分間、穏やかに振とう続けます。

溶かした脳内心臓注入液またはBHI寒天培地を調製し、摂氏55度の水浴に保持し、寒天培地をクロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムで処理します。次に、細菌ファージ混合物を100ミリリットルのフラスコに移します。50ミリリットルの温かいBHI寒天に32ミリグラム/リットルのクロラムフェニコールを加え、よく混ぜます。

混合物を90ミリメートルのシャーレに注ぎます。プレートを摂氏37度でインキュベートします。生成されたコロニーである形質導入剤の耐性をさらに試験するには、コロニーを1リットルあたり32ミリグラムのクロラムフェニコールを補充した新しいBHI寒天プレートに移します。

コロニーPCRによりCFR遺伝子の存在を確認します。レシピエント細胞を、5ミリリットルのTSB中で摂氏37度で振とうしながら一晩培養します。翌朝、0.5ミリリットルの一晩培養物を1.5ミリリットルのチューブに移します。

遠心分離により細胞を沈殿させます。次に、50ミリリットルのチューブに10ミリリットルのCS2培地で細胞を懸濁します。次に、摂氏37度でバクテリアを増殖させ、毎分180回転で振とうし、指数関数後期まで8時間

遠心分離により細胞を回収します。上清を捨て、細胞を10ミリリットルの新鮮なCS2培地に再懸濁します。10 μgの精製プラスミドまたはゲノムDNAを細胞懸濁液に加えます。

毎分180回転で培養物を振る。次に、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を10ミリリットルのBHI培地に再懸濁します。

細胞懸濁液を90ミリリットルの溶融BHI寒天サプリメントと混合します クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラム、および対照実験ではテトラサイクリン1リットルあたり5マイクログラム。90mmのシャーレに注ぎ、素早く冷まして寒天を固めます。適切な抗生物質を含むプレートにつまようじを使用してコロニーを複製し、その耐性特性を確認します。

この結合プロトコルは、表皮ブドウ球菌がCFRドナーとして使用された種内伝播に有用です。そして、黄色ブドウ球菌N315株をレシピエントとして使用した。種間伝達に使用されるプロトコルは、異なる共役ドナーで同じ共役ベクトルを使用して同様の結果をもたらします。

これは、自然変換の詳細が記述された最初の論文です。提供された方法論は、研究者が抗生物質耐性の伝播と拡散、およびヒト病原体黄色ブドウ球菌の主要な決定要因を研究するのに役立ちます。