蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

表皮において。免疫組織化学は、特定のタンパク質が発現している部位を特定するための効率的な手段です。このビデオでは、当研究室で日常的に使用している、表皮におけるタンパク質の免疫局在化のための信頼性の高い方法を実演します。

こんにちは。私はオタワ健康研究所（Ottawa Health Research Institute）の慢性疾患プログラム、低層棟にあるTurin博士の研究室のタミーです。本日は、マウス表皮のパラフィン包埋組織切片を用いた、蛍光抗体による免疫組織化学の手順をご紹介します。当研究室では、BO'S固定組織を用いて表皮分化マーカーを免疫局在化させるためのプロトコルを最適化してきました。

最適化の一環として、固定前に皮膚をペーパータオルの上に広げ、平らに保ちます。この手順には、表皮の剥離、固定、脱水、パラフィン包埋、および切片作成、脱パラフィン、親水化、抗原賦活化、抗体標識、そして最終的な封入と落射型蛍光顕微鏡による可視化が含まれます。それでは、始めていきましょう。

新生仔マウスを使用する場合、背中の皮膚を剃毛する必要はありません。しかし、被毛のある成マウスを使用する場合は、切片作成の妨げにならないよう、背中の皮膚を剃毛させる必要があります。解剖を行う際は、アッセイに使用する皮膚領域にピンセットを当てないよう、細心の注意を払ってください。

そこで、切断する箇所の端をピンセットで挟み、非常に慎重に持ち上げて表皮を切断します。この際、実験に使用したい領域には触れないように注意してください。皮膚を固定する際は、皮膚が丸まってチューブの中に入らないようにし、平らに保つ必要があります。

そこで、固定中に皮膚が平らに保たれるよう、ペーパータオルの上に皮膚を置きます。皮膚をペーパータオルの上で平らに整えたら、次に、ピンセットで損傷させた可能性のある部分を取り除くために、端を切り落とすかトリミングします。その後、皮膚を約2 mm × 2 mmの非常に小さな断片に切断します。

次に、組織の固定を行います。皮膚を扱いやすい大きさに切断した後、ボイン溶液に浸します。チューブに蓋をし、パラフィルムで密閉して、ロッカースタンドに設置します。

一晩のインキュベーションでは、ボイン溶液での処理時間を16〜18時間に留めることが重要です。固定時間が短すぎても長すぎても、組織に損傷を与えます。これでインキュベーションは終了です。

組織をPBSで洗浄し、次に30%、50%、70%のエタノールを用いて段階的な洗浄を行います。BOは黄色を呈しており、洗浄が進みBOが希釈されるにつれて、洗浄液の黄色味が薄くなっていくことが確認できます。各段階で30分間の洗浄を2回ずつ行います。

エタノールによる最後の洗浄後、サンプルを新鮮な70% ethanolに浸し、さらなる処理まで4 °Cで保存します。パラフィン包埋について。凍結組織を用いる利点は、組織の完全性が高く、サンプルを長期間保存できることです。一般的に、コアファシリティを利用することで、より再現性の高い結果が得られます。

ただし、設備が整っており、十分な専門知識を持つ専任のオペレーターがいる場合は、施設内で切片を作成することが可能です。良好な切片を作成して得るのは一種の技術（アート）と言えます。そのため、私たちはコアファシリティを利用しています。

コアファシリティからスライドを回収すると、スライド上にパラフィンが付着していることが確認できます。薄膜状の状態で、スライドをアルミホイルで包んだラックに（焼き芋のように）配置し、55 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、速やかにスライドを取り出し、トルエン中で5分間の洗浄を3回行います。

これらの5分間の洗浄は時間を厳守することが非常に重要であり、インキュベーション時間が長すぎたり、トルエンに浸かりすぎたりすると、試料に悪影響を及ぼします。3回の洗浄とトルエン処理の後、100%エタノールで素早くすすいでください。エタノールとトルエンは沈殿物を形成し、それが実験の妨げになるため、この手順は非常に重要なステップとなります。

次に、スライドを95% ethanolに5分間、70% ethanolに5分間、その後、水に5分間を2回浸すことで、サンプルの親水化を行います。この段階で、組織をH&E染色に供することが可能です。なお、この工程にはコアファシリティも利用しています。

抗原賦活化のため、1回使用のクエン酸緩衝液500 mLを1リットルのプラスチック製ビーカーに入れ、スライドを浸します。金属製ハンドルを取り外してから、ビーカーを電子レンジに入れてください。高出力で5分間を2回加熱します。

2回の加熱処理の間に、電子レンジの扉を開けて冷却させることを忘れないでください。加熱終了後、スライドを沸騰したクエン酸緩衝液から取り出し、温水を満たした染色容器に入れます。ここでは温水（水道水）を使用しており、これはスライドを沸点から室温までゆっくりと冷却させることを目的としています。

次に、スライドをPBSで5分間3回洗浄します。これで免疫組織化学染色の準備が整いました。免疫染色の最初に行うべきことは、ティッシュペーパーを用いて試料の周囲を乾燥させることです。抗体の相互汚染を防ぐため、液体ブロッカーを用いて試料の周囲に境界線を引きます。

シャーレにフィルターペーパーを入れて、加湿チャンバーを準備します。フィルターペーパーを水で濡らし、余分な水分を取り除いてから、スライドを入れてください。加湿チャンバーを使用する理由は、インキュベーション期間中にスライドが乾燥するのを防ぐためです。

描画時にバックグラウンドが高くなるため、スライドを乾燥させないことが非常に重要です。ここで、スライドをインキュベーションバッファーで30分間ブロッキングします。ブロッキング後、スライドをスライドラックに戻し、洗浄バッファーでインキュベートしてください。

先ほどと同様に、余分なバッファーを除去します。スライドを湿潤チャンバーに戻し、一次抗体で1時間、室温でインキュベートします。

1時間のインキュベーションが完了したら、スライドをスライドラックに戻し、洗浄バッファーで10分間を3回洗浄します。洗浄後、ティッシュペーパーを用いて検体周囲の余分な洗浄バッファーを取り除きます。スライドを再び加湿チャンバーに入れ、二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。二次抗体でのインキュベーション後、洗浄バッファーを3回交換し、それぞれ15分間洗浄します。

次に、5分間の洗浄を3回行います。PBSを用いて検体周囲の余剰液を取り除き、スライドの裏面のPBSを拭き取ってから、カバーガラスをスライドに固定します。2.5% DAB溶液を用いて封入を行います。

退色を軽減するため、スライド上に80 µLを滴下します。この際、気泡が入らないように注意してください。その後、カバーガラスを非常にゆっくりと載せます。

気泡が残らないように注意してください。気泡は、モバイルが乾燥した後に写真を撮影したい標本のちょうど上に位置することが多く、不都合であるためです。これで準備が整いました。スライドを確認してください。

FITCフィルターを用いた染色に成功した例を示します。20倍の対物レンズで見ると、表皮のすべての基底上層にClaudin-6が関連していることがわかります。当研究室では、表皮におけるクローディンの発現と局在について非常に強い関心を持っています。

タイトジャンクションおよび表皮透過性バリアの形成に関して、マウス皮膚における免疫組織化学染色の手法を説明しました。この手順を行う際は、組織切片を平坦に保つこと、およびインキュベーションの間にスライドが乾燥しないようにすることが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。