ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング

この手順の全体的な目標は、内視鏡生検から患者由来の食道上皮細胞を拡張して食道疾患を研究すること、またはダウンストリームモデリングまたは食道組織置換のための3D食道足場を作成することです。この方法は、食道疾患における食道上皮細胞の役割をよりよく理解するために使用できます。また、モデリングや移植のための3Dスキャフォールドを見るためにも使用できます。

この技術の利点は、遺伝子組み換えや永久的な改変を必要とせずに、非常に小さな組織片から患者特異的な上皮細胞を作製できることです。この技術の意味は、好酸球性食道炎の病因の理解、および食道閉鎖症および好酸球性食道炎の治療法の開発にまで及びます。一般に、この技術に不慣れな個人は、純度を維持するためにヒト食道上皮細胞を採取する前にフィーダー細胞を完全に除去する能力に苦労します。

この手法を実演するのは、当研究室の技術者であるクリストファー・フォスターです。患者サンプルが採取される少なくとも3日前に、組織処理されたT75フラスコの3T3培養培地に3T3細胞をプレート化します。実験当日、サンプルを採取する直前に、フラスコあたり5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで3T3細胞を37°Cで約5分間剥離します。

ほとんどの細胞が浮いているときは、5ミリリットルの3T3培地を加えて反応を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。ペレットを培地に再度懸濁してカウントします。次に、播種に適した数の細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、25ミリリットルの新鮮な3T3培地を細胞に加え、3000ラドで照射します。次に、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを100mmプレートあたり5ミリリットルの条件付きプログラミング培地に再懸濁します。内視鏡検査時に約6回の食道生検を行った後、完全な無血清ケラチノサイト培地を含む15ミリリットルの円錐管に6回の生検を行い、濡れた氷の上にプリモシンを補充します。

湿った氷の上に5ミリリットルの緩衝ホルマリンに1つの生検を置き、包埋培地を含む小さな生検凍結型に1つの生検を置きます。液体窒素の容器内の氷またはペンタンのビーカーに型をすぐに浸します。組織が凍結したら、クライオモールドをドライアイスの試料バッグに入れ、発泡スチロール容器に入れます。

次に、生検のチューブを、濡れた氷が入ったバイオハザードラベルが貼られた輸送用ボックス内の密封可能なバッグに入れ、両方の容器を密封してラベルを貼り、研究所に輸送します。ラボに入ったら、すぐに凍結生検をマイナス80°Cの貯蔵庫に移し、下流の切片作製またはRNA抽出を行います。サンプルをホルマリンに入れ、摂氏4度の冷蔵庫で一晩固定し、残りの生検を遠心分離機に入れます。

各チューブの培地を10ミリリットルのディスパーゼ溶液と交換し、チューブを水浴中で摂氏37度で15分間インキュベーションするために密封します。インキュベーションの終了時に、生検を再度スピンダウンし、サンプルを0.25%トリプシン-EDTAの5ミリリットルに再懸濁します。生検を1つの100ミリリットルの滅菌プレートに移し、滅菌した2つのカミソリを使用して組織をできるだけ細かく刻みます。

すべての組織を切断したら、組織の断片を新しい15ミリリットルのチューブに移し、0.05%トリプシン-EDTAの5ミリリットルでプレートを2回すすぎます。.洗浄液をチューブにプールし、サンプルを摂氏37度の水浴に戻します。10分後、分解したサンプル片とフィーダーセルを遠心分離し、ペレットをそれぞれ5ミリリットルの条件付きリプログラミング培地に再懸濁します。

次に、フィーダー生検サンプルと食道生検サンプルを1本のチューブに結合し、ローキナーゼ(ROCK阻害剤)を細胞に加えて、ゼラチンでコーティングした組織培養皿で共培養します。約5日後、中程度およびみじん切りにした生検片を吸引して取り出し、5ミリリットルの滅菌PBSで皿を2〜3回すすぎます。最後の洗浄後、ROCK阻害剤を添加した10ミリリットルの新鮮な培地をプレートに加え、細胞が70%の密度に達するまで共培養物をインキュベーターに戻します。

細胞を拡大するには、摂氏37度で5ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを含むフィーダーを2分半以内に取り外します。浮遊供給細胞を取除くために新しいPBSの5ミリリットルの版を洗い流し、生検のサンプル細胞が版の底から緩むまで5から10分のインキュベーションのための0.25%トリプシンEDTAの5ミリリットルを加える。次に、10ミリリットルの新鮮な培地で反応を停止し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。

ペレットを新鮮な条件付き再プログラミング培地に再懸濁してカウントし、次に、新しい円錐形のチューブに10〜6番目のヒト食道細胞を1回計上します。6番目に照射した3T3細胞を食道細胞に1.2倍の10を加え、新鮮な条件付きリプログラミング培地でチューブ内の総容積を15ミリリットルにします。次に、新鮮なROCK阻害剤を細胞に加え、ゼラチンでコーティングされた150mmの皿に共培養物をプレートします。

マイナス80°Cの貯蔵のために食道細胞を凍結するには、ちょうど示したようにフィーダーを取り外し、食道細胞を切り離します。次に、細胞を新しい50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離し、ペレットを凍結中濃度2ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1回で再懸濁します。次に、2ミリリットルの細胞を事前に標識した各クライオビアルに移し、サンプルを摂氏マイナス80度で少なくとも24時間保存してから、液体窒素の長期保存に移します。

上皮細胞のコロニーは約4〜5日で形成され、線維芽細胞フィーダー細胞に囲まれます。これらのコロニーが拡大すると、他のコロニーと合流してより大きなコロニーを形成します。文化が70%コンフルエントになったら、それらを拡大する必要があります。

フィーダー細胞を除去した後、接着性上皮細胞をトリプソン化し、新たに照射したフィーダー細胞に再播種することができます。qRT-PCRによるこれらの細胞の表現型の特徴6onは、最初のバイオスパイサンプルと比較して、継代1の終わりにある前駆細胞マーカーであるP63のアップレギュレーションを明らかにし、細胞がより前駆細胞の幹様状態に再プログラムされたことを示しています。これらの細胞を正常組織培養プレートに移すと、P63の発現が減少し、タイトジャンクションプロテインワン(TJP1)とE-カドヘリンの発現が増加することから、前駆細胞からより分化した上皮細胞への表現型シフトが見られます。

継代後の細胞のフローサイトメトリー解析では、90%以上の細胞がEpCAM陽性であることが示されています。免疫蛍光染色は、細胞が上皮マーカー、前駆細胞マーカー、増殖マーカー、および上皮タイトジャンクションタンパク質の発現を保持していることを示しています。非疾患患者からの食道細胞の倍加時間は約36〜40時間と計算されていますが、疾患細胞の倍加時間は遅くなる可能性が高いです。

このテクニックをマスターすると、約1時間で完了します。この手順を試みるときは、汚染を防ぐために滅菌技術を使用し、細胞の生存率を維持するために迅速に作業するようにしてください。この手順に続いて、トランズウェル培養などの他のアッセイを実施して、どの抗原が食道の炎症を引き起こしているか、または病因を引き起こしているかを評価することができます。

開発後、このアッセイは、研究者が好酸球性食道炎を引き起こすトリガー抗原を特定する道を開くだけでなく、これらの患者を治療するための新しい治療オプションを開くでしょう。このビデオを見れば、内視鏡生検から食道上皮細胞を分離および拡大して、食道疾患の研究や3Dモデルの生成に使用する方法について十分に理解できるはずです。鋭利な器具や生体組織を扱う作業は危険な場合があることを忘れないでください。

鋭利な器具は適切に廃棄し、適切なバイオセーフティー対策を講じてください。