成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

本実験の全体的な目的は、複雑な装置や技術を必要とせずに、ラット肝細胞の混合一次培養から複数のマクロファージ培養を得ることです。まず、コラゲナーゼ灌流によって成体ラットの肝細胞を解離させ、続いて実質細胞である肝細胞画分を分離します。次に、これらの細胞を増殖培地とともにT 75組織培養フラスコ内で培養し、肝細胞の混合一次培養を確立させます。

その後10〜12日間培養し、培養フラスコを振盪してマクロファージをプラスチック皿に転移させ、短時間のインキュベーション後、選択的接着により回収します。最終的に、同一のT 75組織培養フラスコから、2〜3日おきに2週間以上にわたって、6個以上の細胞を繰り返し回収することが可能です。肝マクロファージの分離方法は十分に記述されています。

しかしながら、従来の手法の多くは、遠心分画装置のような高度な設備や、熟練した技術的スキルを必要とします。本研究では、特別な設備や高度な実験スキルを必要とせず、成体の肝細胞の混合一次培養から十分な数と純度の肝マクロファージを得るための、簡便で新しい手法を提示します。動物の解剖、肝臓の灌流、および細胞の調製について、国立動物衛生研究所のNorco博士、山中博士、および吉岡美子博士によって実演します。

次に、国立農業生物科学院のTaketo Takeno博士による、培養組織からの肝マクロファージの単離および精製について説明します。それでは始めましょう。ラット肝臓の灌流の準備として、まず洗浄液1瓶とコラゲナーゼ溶液1瓶を予熱してください。

次に、皮膚をつまんで鎮静を確認した後、麻酔をかけた成体雄ラットをステンレス製パンに入れ、腹部と胸部に70% ethanolをスプレーします。続いて、解剖用はさみで腹部中央に小さな切開を加え、皮膚を剥離します。その後、はさみで腹腔を開き、門脈の位置を確認します。

次に、門脈の下に手術用糸を通し、緩く締め付けます。続いて、肝臓への血液逆流を防ぐため、下大静脈の遠位端と腸間膜静脈を蚊式鉗子でクランプします。横隔膜をはさみで切開して胸腔を開き、心臓を露出させます。その後、眼科用はさみで門脈に小さな切開を加え、2 mmのプラスチックカテーテルを静脈内に挿入し、カテーテルの周囲で糸をしっかりと締め付けます。

灌流システムに予熱した洗浄液を充填し、カテーテルに接続します。10 milliliters per minuteの速度でC twoの灌流を開始します。同時に、解剖用ハサミを用いて右心房壁を切開します。

灌流を10分間継続し、その後、灌流液をコラゲナーゼ溶液に切り替えて10〜20分間灌流します。1分間あたり10 mLの速度で、滅菌ビーカーに25 mLのコラゲナーゼ溶液を満たします。次に、灌流した肝臓を取り出し、注意深くビーカーに入れます。

ハサミを用いて肝臓を細かく刻みます。得られた細胞懸濁液に冷えたMEMを75 milliliters加えます。緩やかにピペッティングした後、懸濁液を100 micrometerのセルストレーナーでろ過します。

未消化の組織断片から結合組織を除去するため、ろ液を50 mLコニカルチューブに回収します。ろ液を50 mLコニカルチューブに移し、まず4°Cで50 Gで1分間遠心分離して細胞を沈殿させ、この操作による洗浄を4回繰り返します。ブレーキをオフにした状態で上清を慎重に廃棄し、ペレットを冷えたMEMで再懸濁させ、最後の洗浄後に再度細胞を遠心分離して沈殿させます。

肝細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞を5〜10本のT 75組織培養フラスコに、6.7 × 10⁴ cells/cm²の密度で播種します。培養フラスコをインキュベーターに入れ、2〜3日ごとに増殖培地を交換してください。

1日間の培養後、実質肝細胞はフラスコ表面に広がり、1つまたは2つの円形核を持つ、典型的な多角形のコパル石状の形態を示します。培養後数日で、実質肝細胞は上皮細胞としての形態を失い、より扁平な線維芽細胞様細胞へと変化します。6日目頃になると、位相差顕微鏡下で明るく円形のマクロファージ様細胞が、線維芽細胞様細胞のシート上で増殖し始めます。マクロファージ様細胞の増殖は、12日目頃に最大レベルに達します。

線維芽細胞シートが変性し始める19日目頃に、マクロファージ様細胞の数が減少します。そのため、培養7〜10日目頃に、細胞シート上で増殖したマクロファージを、培養フラスコを30分間交互に振盪して培養液中に懸濁させます。2本のT 75フラスコ分の中身を、100 mmの非組織培養グレードプラスチックディッシュにそれぞれ分注してください。

培養フラスコに増殖培地を補充し、インキュベーターに戻します。培養期間終了後、プラスチックディッシュを30分間インキュベートし、培地を吸引してPBSで優しくすすぐ洗浄操作を3回行います。ここに示すように、マクロファージ様細胞を播種してから10分も経てば、これらの細胞はディッシュ表面に接着しますが、混入している他の線維芽細胞は懸濁したままとなります。PBSで洗浄することで、高純度なマクロファージ集団が得られます。

この図に見られるように、細胞は40分間の培養後に典型的なマクロファージの形態となり、矢印で示されるように有糸分裂細胞が頻繁に観察されます。この新たに高純度化されたマクロファージ集団を回収するために、洗浄した細胞に1 mLのTrypLE Express溶液を加え、ディッシュをインキュベーターに戻してさらに10分間静置します。このインキュベーション後、9 mLの増殖培地を加え、セルスクレーパーで付着したマクロファージをやさしく剥離させて15 mLコニカルチューブに移し、遠心分離して上清を捨てます。

1 mLの増殖培地を加え、激しくピペッティングすることで再懸濁した細胞塊を単一細胞へと分散させ、このグラフに示すように血球計数器を用いて細胞数を計測します。T 75培養フラスコから2〜3日おきに繰り返し回収することで、2週間以上にわたり10^6個以上の細胞を回収でき、T 75培養フラスコ1本あたり合計10^7個の細胞収量を得ることが可能です。これらの画像に示すように、単離された細胞は、CD 68またはED 1、およびCD 1 72 AまたはOX 41などのラットマクロファージ抗原に対するモノクローナル抗体で免疫染色されています。これらの細胞は、FITC標識マイクロビーズの能動的な食作用など、マクロファージとしての機能的特性を有していました。

本ビデオでは、成体赤肝細胞の混合一次培養からマクロファージを得るための、シンプルで効率的な手法を提示しました。本手順は複雑な装置や技術を必要としませんが、同一のブラス培養から繰り返し回収可能な、十分な数の純粋なマクロファージを提供します。この手法は、他の哺乳類種にも適用可能です。

ビデオをご視聴いただきありがとうございました。今後の実験の成功をお祈りしております。それでは。