準備とインビトロキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、マイクロRNAによる細胞改変と並行細胞磁化を確実にする技術を導入することです。この方法は、再生医療分野の主要な課題に対処することができます。移植前の細胞の遺伝子工学など。

マイクロRNAによる効率的な細胞改変に加えて、酸化鉄によるそれを可能にしました。これは、磁場印加により目的側の細胞保持を強化するために使用できます。細胞療法は、心臓病の治療、低細胞保持、および細胞生存率の改善が緊急に必要とされるために非常に有望です。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているトランスフェクション複合体の調製において、ヒト臍帯静脈内皮細胞培養で開始します。トランスフェクションの48時間前に、適切なサイズのプラスチック細胞培養ウェルプレートにHUVECを播種します。開始細胞密度は、成長面の平方センチメートルあたり約13,000細胞です。

次に、新しいmiR /ポリエチレンイメン/超常磁性酸化鉄ナノ粒子を調製します。まず、細胞増殖表面1平方センチメートルあたり2.5ピコモルのマイクロRNAと5パーセントグルコース溶液を希釈して、マイクロリットルあたり0.125ピコモルのマイクロRNAの最終濃度を得る。次に、PEIを等量の5%グルコース溶液で希釈します。

希釈したPEIをmicroRNA溶液に加え、得られた混合物を30秒間ボルテックスします。次に、miR/PEI混合物を室温で30分間インキュベートします。室温の超音波処理水浴中で少なくとも20分間MNPを超音波処理します。

次に、調製したmiR/PEI混合物に適切な量のMNP溶液を加えます。30秒間ボルテックスした後、室温で30分間インキュベートします。次に、調製した miR/PEI/MNP 混合物を細胞上の培地に直接滴下します。

トランスフェクションの6時間後に、この混合物を新鮮な培地と交換してください。テキストプロトコールに記載されているベクターの安全性を解析した後、共焦点および超解像構造化照明顕微鏡により、トランスフェクション複合体の細胞内局在を確認し、特性評価します。これを行うには、以前と同様に、24ウェル培養プレートのウェルに配置されたゼラチンコーティングされたガラスカバースリップにHUVECを播種します。

miR/PEI/MNP と標識された 3 色標識で細胞をトランスフェクションし、二酸化炭素 5% を含む加湿雰囲気下で摂氏 37 度で 24 時間インキュベートします。最初に2%のウシ血清アルブミンとリン酸緩衝生理食塩水でカバースリップを洗い、次にPBSだけで洗います。4%のパラホルムアルデヒドまたはPFAを摂氏37度で15分間インキュベートして細胞を固定します。

PBSで洗浄し、標準プロトコルに従ってDAPIで核を染色します。次に、細胞をPBSで3回15分間シェーカーで洗浄し、余分な色素を取り除きます。準備したカバースリップを適切な封入剤を使用して顕微鏡スライドに置き、スライドを少なくとも1時間乾燥させてから顕微鏡観察に使用します。

テキストプロトコルのSIM設定で63倍の油浸対物レンズを使用して画像を取得します。細胞の標的化およびin vitroでの動的条件のシミュレーションを行うには、まず、前回と同様にHUVECを24ウェルプレートにトランスフェクションします。それらを24時間インキュベートした後、細胞を洗浄します。

次に、PBSで希釈したEDTAに1回トリップを加え、細胞を摂氏37度で4分間インキュベートしてから細胞を回収します。採取した細胞をGの300倍で10分間遠心分離します。1つのウェルから得られた細胞ペレットを1ミリリットルの新鮮な培地と混合します。

そして、細胞を12ウェルプレートの1つのウェルに移します。小さな磁石をテープで固定します。培養プレートをシェーカーに置き、細胞懸濁液を150 RPMで12時間インキュベートして、動的条件をシミュレートします。

次に、細胞を洗浄し、4%PFAを使用して固定します。DAPIで核を染色します。Zスタックモードの405および504 10ナノメートル励起レーザーを用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して細胞付着を記録し、生データを取得します。

最大強度の投影画像処理を使用して、分析用の画像を作成します。磁気反応細胞および非応答性細胞の定量分析では、まず24ウェルプレートでHUVECをトランスフェクションします。細胞を24時間インキュベートしてから、前述のように細胞を洗浄して収集します。

各ウェルから得られた細胞ペレットを、加温した滅菌細胞選別緩衝液500μLで再懸濁します。付属の磁石で固定された磁気ソーティングカラムにセル懸濁液を塗布します。次に、磁石でカラムを新しい細胞選別バッファーで3回洗浄します。

フロースルーを磁気的に応答しない画分として収集します。磁石からカラムを取り外し、プランジャーを使用してカラムを考えた新鮮な細胞選別バッファーを押すことにより、磁気応答性細胞画分をすぐに収集します。Mag-フラクションとMag+フラクションの両方をGの300倍で10分間遠心分離します。

細胞ペレットをPBSに再懸濁した後、細胞をカウントし、トリパンブルー排除アッセイで細胞生存率を評価します。臍帯から単離されたHUVECは、内皮マーカーCD31の発現と、基底膜マトリックス上にチューブが形成されることを特徴としています。miR/PEI/MNP でトランスフェクションされた HUVEC はすべて、タグ付き miR を取ります。

そして、トランスフェクション後24時間でも生存は影響を受けません。さらに、超解像顕微鏡法は、3色標識トランスフェクション複合体のパラ核局在を示しています。PEI毒性は、miR/PEIトランスフェクション細胞の機能低下によって確認されます。

重要なことに、MNPは細胞特性を回復させます。miR/PEI/MNP修飾細胞は、チューブ形成の点で未処理の細胞と違いはありません。さらに、これらの細胞は、光退色後の蛍光回復を通じて明らかになるように、細胞間ギャップ結合部のコミュニケーションを維持しています。

回転するシェーカー上に置かれた培養プレートのウェルにmiR/PEI/MNP 修飾細胞の懸濁液を播種すると、細胞は移動して局所磁石の適用領域に付着する傾向があります。代表的な画像は、磁石を塗布した領域での細胞増殖を示しています。マグネット塗布なし。

そして、液体の流れが細胞を集中させていた培養井の中央に。一度習得すれば、細胞トランスフェクションは2時間で行うことができます。このビデオを見た後、磁化を含む内皮細胞を一過性でありながら高効率に修飾する方法について非常に良い印象を持つはずです。

また、細胞製品を最終的に特徴付ける方法も重要です。この手順を試行する際は、トランスフェクション複合体の調製、インキュベーション時間、およびトランスフェクション後の洗浄ステップについて、細胞播種成分の量について所定の数値に従うことが重要です。私たちは、このアプローチが他の罹患臓器の治療のために他の細胞タイプにうまく移行できると非常に楽観視しています。

この手順に従って、改変された磁化細胞を用いたin vivo研究を行うことができます。彼らは、細胞の鉄装填が関心のある側での細胞の保持を確実にするために効率的であるかどうかという追加の質問に答えることができます。また、in vivoでのMRIによる検出の限界を定義することも必要です。