定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

この方法論の全体的な目標は、亜集団を区別しながら、穿孔に対する異細胞集団の動的な表現型応答を定量的に評価することです。ほとんどの生理学的相互作用は、複数の細胞タイプの存在下で発生します。この方法は、細胞生物学者が、不均一な細胞が同じ環境圧力にどのように反応するか、および異なる細胞が互いにどのように影響し合うかを評価するのに役立ちます。

この手法にはいくつかの利点があり、複数の細胞タイプを区別し、出生率と死亡率、形態学的ダイナミクスなどの亜集団の同時分析を可能にします。このプロトコルは多くの生物学的プロセスの研究に使用できますが、H3255腫瘍細胞と化学療法薬であるエルロチニブで処理されたCCD19LU線維芽細胞を使用したワークフローを示します。まず、テキストプロトコルに従ってチューブ内の細胞懸濁液を調製した後、チューブを反転させて溶液中の細胞を混合し、播種を標準化します。

次に、各細胞懸濁液の10マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにピペットで移し、トリパンブルーの10マイクロリットルを追加します。溶液10マイクロリットルを細胞計数スライドにピペットで移し、スライドを自動セルカウンターに挿入します。セルカウントを少なくとも3回、または得られたカウントが一致するまで繰り返します。

マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのウェルで100マイクロリットルのRPMIに合計1,500個の細胞を播種します。各細胞懸濁液を、各時点で同一のプレートセットアップで三重にプレートします。細胞を一晩インキュベートします。

エルロチニブ粉末にDMSOを添加して、10ミリモルのエルロチニブストック溶液を作ります。次に、細胞培養培地を使用して、薬物を最高最終濃度の10マイクロモルの2倍に希釈します。薬物を1:10の比率で4回連続希釈し、合計5つの薬物濃度と薬物制御なしを実現します。

100マイクロリットルの薬物溶液を細胞の96ウェルプレートの適切なウェルにピペットで移し、最終薬物濃度を培地で希釈した1倍にします。次に、蛍光ベースの分類のために細胞を染色するために、PBSで核染色のミリリットルあたり5マイクログラムと5マイクロモルの死細胞染色を調製します。形態学に基づく分類では、PBS中の核染色液1ミリリットルあたり5マイクログラム、5マイクロモルの死細胞染色剤、および5マイクロモルの細胞染色液を調製します。

各ウェルに20マイクロリットルの染料溶液を加えます。次に、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。画像を取得するには、70%エタノールを使用してプレートの底を拭き、プレートをイメージングチャンバーに入れます。

[設定] タブの [チャンネル選択] で、プラス ボタンをクリックして、画像に適切なチャンネルを追加します。レイアウト選択で、2 ミクロンごとに 0 ミクロンから 20 ミクロンまで z スタックのテスト画像を設定して、焦点面を特定します。各チャンネルの下にある「スナップショット」をクリックして、強度を評価し、露光時間を最適化します。

必要に応じて、時間内に高い値または低い値を入力します。細胞内の核は、下流の分析の精度を確保するために焦点が合っている必要があります。プレートの概略図で、適切なウェルを強調表示します。

次に、井戸のスケマティックで、同様の方法で画像化する 25 のフィールドを強調表示します。「run experiment」で、プレート名でプレートを特定し、「start」ボタンをクリックして、10倍対物レンズで画像取得プロトコルを実行し、選択したチャンネルでグレースケールTIFF画像を生成します。オープンソースソフトウェアであるCellProfilerおよびCellProfiler analysisをインストールした後、CellProfilerを開き、File、Import、Pipeline from fileの順にクリックし、適切なファイルを選択します。

蛍光ベースの分類パイプラインを選択して、細胞を H3255 または EGFP 強度に基づく CCD19LU のいずれかに分類し、形態の特徴を計算します。[出力設定の表示] をクリックし、分析用の画像ファイルの場所と抽出されたデータの宛先を選択します。解析を実行する前に、プロトコルをテストモードでテストして、パラメータ値を確認する必要があります。

核と細胞のセグメンテーションが正確であることが重要です。このプロトコルは、さまざまな核染色を持つ細胞を同定し、核が拡大するピクセル値が、最も高いDNA染色で核をマスクするのに十分な大きさであるが、周囲の核をマスクしないほど小さいことを確認するために設計されました。蛍光に基づいて集団を分類するには、まずGFP強度範囲を再スケーリングし、次に同定された各核のGFP強度を測定し、ユーザー定義の閾値に基づいてオブジェクトを分類します。

次に、[画像の分析] をクリックして分析を開始します。解析が完了したら、デフォルトの出力フォルダに移動して、計算されたデータを表示します。形態学に基づく分類では、細胞プロファイラーで適切なプロトコールを実行し、全細胞の形態学的特徴を生成します。

Cell Profiler Analysisソフトウェアを開き、Cell Profilerで生成されたデータベースプロパティファイルを選択し、クリックして開きます。画面の左上にある「分類子」タブをクリックします。実験からランダムな細胞画像を呼び出すには、フェッチをクリックすると、画像が未分類のウィンドウに表示されます。

セルを手動で正または負に分類します。ここでは、H3255またはCCD19LUを表し、セルを選択して適切なビンにドラッグします。亜集団ごとに少なくとも 50 個の細胞を分類した後、[Train Classifier] をクリックし、[Check Progress] をクリックします。最後に、[Score All] をクリックして、各サブポピュレーションの細胞数を含むテーブルを生成します。

H3255腫瘍とCCD19LU線維芽細胞のヘテロ細胞低温培養において、DNA染色に基づいて核を同定し、セグメント化しました。細胞集団は、人工的に誘導された蛍光または機械学習アルゴリズムのトレーニングによって分類され、形態の違いに基づいて細胞タイプを同定しました。蛍光と形態学に基づく方法論との間には高い一致があります。

2つの分類方法は、同じ画像に独立して示唆され、未処理の集団と治療された集団でそれぞれ97.4%と92.5%が一致しました。ここでは、エルロチニブ治療に対する細胞形態と反応の変化を調査しました。薬物治療の3日間後、H3255細胞から核面積の減少と細胞面積の増加が観察されました。

これはおそらく細胞死によるものでした。エルロチニブが細胞に対して細胞傷害性または細胞増殖抑制効果を有するかどうかを調べるために、ヨウ化プロピジウム染色に基づいて死細胞を同定した。H3255細胞に対するエルロチニブの細胞傷害性および細胞増殖抑制性の両方の効果が観察され、薬物治療後の死亡数の増加と出生数の減少が認められました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、連続しない2時間で行うことができます。この手順に続いて、RA干渉やCRISPRなどの他の方法を実行して、機能ゲノミクスを調査する追加の問題に対処することができます。その開発後、この技術は、がん生物学分野の研究者が複数の種類のがんの腫瘍進行に対する間質細胞の影響を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、環境刺激に対するヘテロセルラー応答の研究方法、特に顕微鏡ベースのイメージングデータをハイスループットで分析する方法について十分に理解できるはずです。