マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

この方法の全体的な目標は、ヒト細胞キャリアの足場をマウスに移植してヒト化された骨髄ニッチを作成し、インプラント内のヒト細胞の挙動をライブイメージングすることです。この方法は、骨髄のさまざまな成分を単一細胞解像度で再現し、ライブ画像を作成することができるため、ヒト造血場の主要な質問に答えるのに役立ちます。このシステムの汎用性は、異なるニッチコンポーネントを1つずつ、または組み合わせて移植できるため、その主要な利点の1つです。

この方法論は、腫瘍転移や薬物スクリーニング研究など、他の研究分野にも適用できる可能性があります。適切な滅菌技術を使用して、滅菌したゼラチンスポンジを同様のサイズの24個に切断することから始めます。ゼラチン足場をエタノールに浸し、次にPBSに浸して再構成します。

次に、各足場を滅菌組織にそっと軽くたたいて余分な液体を取り除き、足場を超低アタッチメントの24ウェルプレートの個々のウェルに移します。インスリン注射器を用いて、50マイクロリットルの培地中の10〜5〜1×6の間質細胞を各足場に1回〜10〜6回ずつ慎重に注入し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。細胞を足場に注入するときは、足場から漏れがないことを確認してください。

1時間後、各ウェルに3ミリリットルの新鮮な細胞培養培地を充填し、足場をインキュベーターに戻します。24時間後、第5造血細胞に10〜10個を1回足場に注入し、続いてインキュベーションとさらなる培地添加を行い、今示したように24時間インキュベーションする。組換えヒト骨形態形成タンパク質2キャリア足場の生成のために、再構成された足場をU底96ウェルプレートの個々のウェルに配置し、各足場に2つずつ5マイクロリットルの組換えヒト骨形態形成タンパク質を追加する。

次に、足場を20マイクロリットルのトロンビンと20マイクロリットルのフィブリノーゲンで覆います。バイオエンジニアリングされた足場の外科的移植には、まず実験マウスの背中の手術領域を剃り、希釈したクロルヘキシジンに浸した綿先を使用して、露出した皮膚表面を各方向に3回洗浄します。次に、滅菌鉗子とメスを用いて皮膚に前後0.5〜0.7センチの切開を行い、皮下組織の下に鉗子を挿入してポケットを作ります。

足場をポケットの奥深くに挿入し、切開部を外科用接着剤で塞ぎます。移植された足場が外植片の8〜24週間前に発達するのを待ちます。蛍光物質の静脈内投与と動物の安楽死後、示したように皮膚を滅菌し、動物の背中、元の着床部位の近くに縦方向の皮膚切開を行います。

足場を埋め込んだ皮下ポケットから皮膚を慎重に分離し、ピンセットで足場を優しくつかみ、足場を囲む残留膜と組織を慎重に切断して構造を回復させます。速効性接着剤を使用して、足場を35 x 10ミリリットルのペトリ皿に固定します。骨形態形成タンパク質の2つの足場の場合、プレートにPBSを充填する前に、顕微鏡顕微鏡で手術用マイクロドリルを使用して骨表面を薄くし、蛍光色素の可視化と画像の高解像度キャプチャを可能にします。

穴あけ加工では、通常、骨の厚さが足場によって異なり、表面を壊さないようにすることが重要であるため、特に注意してください。皿に室温のPBSを入れます。バイオエンジニアリングされた足場の2光子顕微鏡イメージングでは、足場を共焦点顕微鏡ステージに置き、1.0 NAの20倍の水浸レンズを選択します。

次に、イメージングソフトウェアの取得モードで、[手動ツールの表示]ボックスを選択します。レーザーメニューで、2光子レーザーのスイッチを入れ、レーザーがウォームアップして安定するのを待ちます。レーザーの準備ができたら、イメージングセットアップメニューでチャンネルモードをアクティブにし、フレームごとにトラックを切り替えます。

ライトパスメニューで、ノンデスキャンとメインビームスプリッターMBS 760 plusを選択します。デスキャンされていない 4 つの検出器をアクティブにし、回路図に示すように構成を設定します。チャンネルメニューで、レーザー波長を890ナノメートルに、出力を50%に設定し、各チャンネルのゲインマスターを500〜600に、デジタルオフセットをゼロに、デジタルゲインを15に設定します。

取得モードでは、組織を損傷したり蛍光色素を漂白したりすることなく、高解像度の画像を取得するための適切なパラメータを設定します。次に、画像の初期スキャンでズームを 1 に設定します。すべてのパラメータを設定したら、レンズを生理食塩水に触れるまで下げ、ランプを光源としてレンズの焦点を手動で設定します。

次に、Zスタックメニューをアクティブにして、最後の最初の機能を選択します。2つのサブシーケンシャルスライス間の必要な間隔を設定し、サンプルのライブスキャンをライブで画像化するためにライブを選択し、必要に応じてデジタルゲインとデジタルオフセットを調整して最適な露出を実現します。複数のチャンネルを同時に視覚化するには、分割機能を選択します。

ステージメニューで、ライブモードで画像をスキャンし、骨空洞の位置など、関心のある領域をマークします。サンプルスキャンが完了したら、最初の関心領域に移動し、ライブモードのset first関数とset last関数を使用して、関心領域を囲む3D Zスタックの上部と下部を設定します。次に、中心をCに設定し、実験開始ボタンをクリックして、関心領域のZスタック画像取得を開始します。

取得が完了したら、指定したフォルダに画像を保存し、次に関心のある領域をスキャンします。これらの代表的な画像では、移植後8週間で免疫不全のNSGマウスから回収された異なる足場の肉眼的形態を観察することができます。ヒト内皮細胞との共播種は、足場の血管新生を増加させ、一方、組換えヒト骨形態形成タンパク質2の添加は骨形成を誘導する。

これらの足場は、生きた2光子顕微鏡によって画像化され、足場内の血管の存在と、足場実質におけるヒト造血細胞の長期生着を明らかにします。ヒト内皮細胞と間葉系間質細胞を播種したスキャフォールドは、スキャフォールド内の血管形成におけるヒト内皮細胞の関与を示しており、その結果、マウス-ヒトキメラ血管系ができあがります。骨組織の形成は、2光子顕微鏡法によって視覚化できるだけでなく、骨髄内膜組織に非常に似ている骨内膜組織のヒト化血管系における空洞の形成も視覚化できます。

さらに、組換えヒト骨形態形成タンパク質の2つのキャリア足場では、足場内の組織の形態が脂肪組織を伴う成熟骨髄に類似しており、ヒト間葉系間質細胞も脂肪組織形成に寄与していることが示唆されています。このビデオを見た後、すべてのバイオエンジニアと主要なマウスの足場についてよく理解しているはずです。常に禁欲的な環境を維持し、足場の取り扱いには細心の注意を払うことを忘れないでください。

この方法に関連する制限(組織のヒトマウスキメラなど)に留意してください。イメージング後、足場を消化できるため、サンプルをさらなる研究に使用できるため、サンプルから生細胞を回収できることを忘れないでください。