形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法
2018年1月11日
この原稿は、形態および齧歯動物の下顎内携帯電話の変更を分析するための方法を示します。
この実験の全体的な目標は、X線写真の形態測定と組織学的分析を使用して、マウスの下顆軟骨の圧縮負荷の影響を観察することです。これらの指標は、げっ歯類の下顆内の構造的および細胞的変化に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。ここに示す手法の主な利点は、他の小さな生まれた動物や参加した動物の分析に使用できることです。
このプロトコルでは、分離され、解剖されたマウスの下顎骨がすぐに使用できます。ペトリ皿の上で、下顎骨をX線キャビネットシステムに移します。次に、26キロボルトで5秒間X線写真を撮ります。
次に、分析ソフトウェアで画像を開いて、形態測定を行います。まず、ユニットボタンを使用してスケールバーを設定します。次に、マーカースタイル2を使用して6つの解剖学的ポイントを選択します。
まず、下顆の最も後方の点をポイント1として選択します。次に、ポイント 2 の切開プロセスを選択します。次に、ポイント 3 のシグモイド ノッチで最も深いポイントを選択します。
次に、下顎枝の凹面の最も深い点である点4を選択し、次に、顆関節面の最も前方の点である点5を選択します。次に、顆関節面の最も後方の点を点6として選択し、長さツールを使用して長さの測定を続行します。次に、ポイント3から4までの垂線ツールを使用して、ポイント1からポイント3と4の間の線までの垂線の長さである顆頭の長さを測定します。
次に、ポイント1と2の間の下顎の長さを測定します。最後に、ポイント5と6の間の顆頭の幅を測定します。データを保存するには、画面右側の測定リストをコピーします。
固定されているが脱灰していない下顎骨を埋め込む前に、PBSの30%スクロースに一晩浸します。翌日、余分な軟部組織を解剖し、下顆を慎重に切り取ります。次に、サンプルをプラスチック型に入れ、顆の内側表面を型の基部に当て、サンプルを型の底部と平行にします。
その後、包埋用樹脂に浸し、ドライアイスで樹脂を冷やします。次に、さらに埋め込み樹脂で型を仕上げます。それらを冷凍庫またはドライアイスで冷却した冷たい2つのメチルブタンに移します。
冷やしたら、試料をマイナス20°Cまたはマイナス80°Cで保存して切片化します。顆の矢状切片のMCCにおけるCol10a1発現を定量化するには、画像解析ソフトウェアパッケージで組織学的画像を開き、なげなわツールを使用して関心のある領域を選択します。この場合、MCC 地域が選択されます。
ヒストグラム ボックスに報告される領域内のピクセル数をメモします。次に、色の範囲を調整してCol10a1の赤いピクセルを選択します。スポイトツールを使用して画像から赤いピクセルを選択し、[OK]をクリックします。次に、ヒストグラムボックスに報告された領域内の赤いピクセルの数を記録します。
領域内の赤いピクセルの割合は、Col10a1 の発現量を表します。次に、同じ基本的な手法を使用して、MCCおよび軟骨下骨のTRAP活性を定量化します。まず、軟骨下骨領域の軟骨を解析する領域として選択し、総ピクセル数に注目します。
次に、ELF97基板によって生成された黄色のピクセルを選択します。正のピクセルの数に注意し、TRAPの正のピクセルの割合を計算します。次に、DEPIによって青色で対比染色されたEDU陽性細胞を定量します。
再度、対象領域を選択し、その中の青色のピクセルを定量化します。また、この方法を使用して、同じ領域内の EDU 正のピクセルの数を決定します。圧縮性TMJ負荷を受けたマウスの形態測定では、負荷によって下顎骨と顆頭の長さが大幅に増加したことが示されました。
それにもかかわらず、荷重は顆幅の大きな変化をもたらさなかった。コラーゲン分布の定量化により、負荷を受けた動物の顆のCol10a1発現とMCCの有意な増加が明らかになりました。一方、Col2a1の発現はコントロールとあまり変わらなかった。
TRAP活性は、顆および負荷を受けたマウスの軟骨下領域で増加し、亜増殖も増加しました。EDU染色は増殖細胞の数を示します。MCCにおけるプロテオグリカン分布は、トルイジンブルー染色領域と距離マップを評価することにより定量化した。
負荷されたグループの顆のMCCでの距離マッピングが大幅に増加しました。しかし、プロテオグリカン染色領域は群間で統計的に差がありませんでした。このビデオを見た後、げっ歯類の下顆の細胞と構造変化を分析する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
本稿では、げっ歯類の下顎凝集における形態計測学的および細胞学的変化を分析する方法を提示します。本研究では、マウスの下顎凝集軟骨における圧縮負荷の影響に焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 整形外科
背景
- 下顎骨における構造的および細胞的な変化を理解することは、さまざまな生物学的研究において極めて重要です。
- 圧縮負荷は、軟骨の健康状態や発達に影響を及ぼす可能性があります。
- げっ歯類は、人間と解剖学的な類似性があるため、これらの変化を研究するためのモデルとして利用されます。
- これらの変化を評価するには、放射線学的および組織学的な解析が不可欠です。
研究目的
- 下顎 condylar cartilage への圧縮負荷の影響を観察すること。
- 形態計測を用いて構造的な変化を評価すること。
- 他の小型動物に適用可能なプロトコルを提供すること。
使用方法
- マウス下顎骨の分離および解剖。
- 下顎骨のX線キャビネットシステムへの転送。
- 26 kilovoltsで5秒間の放射線撮影。
- 細胞変化を評価するための組織学的解析。
主な結果
- 下顎顆における形態計測学的変化の特定。
- 圧縮荷重による細胞変化の評価。
- 使用したイメージング技術の有効性の実証。
- 他の小動物研究における本手法の潜在的な応用。
結論
- 本研究は、軟骨に対する機械的負荷の影響について貴重な知見を提供しています。
- 開発された手法は、生物学的研究におけるより広範なアプリケーションに適応させることが可能です。
- 圧縮負荷の長期的な影響を探索するために、さらなる研究が必要です。
よくある質問
産業界における重要性
この手法により、圧縮荷重下におけるマウス下顎骨顆の構造的および細胞的な適応を定量的に評価することが可能となり、顎関節症に関連するメカノバイオロジー研究のための前臨床モデルが提供されます。機械的刺激を、Col10a1発現、TRAP活性、プロテオグリカン分布などの分子生物学的および組織学的エンドポイントに結びつけることで、本アプローチは軟骨恒常性経路におけるターゲット検証を支援します。この形態計測およびイメージングのワークフローは、顎の発達や変形性関節症の状態における治療仮説のリスクを低減するための、拡張性と再現性を備えたプラットフォームを提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：コラーゲン発現量および細胞増殖の定量化を通じて、下顎関節結節 cartilage におけるメカノトランスダクション経路の解析を可能にする。
- 実用的価値：軟骨リモデリング過程における標的への作用を検証するための、標準化された形態計測および組織学的リードアウトを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ピクセルベースの蛍光強度および距離マッピングを含む定量的出力を生成し、細胞外マトリックスの変化を再現可能な方法で評価できる。
- 実用的価値： 汎用的なイメージングツール（Digimizer、蛍光顕微鏡）を用いて、小骨モデルにおけるコラーゲンおよびプロテオグリカン解析のための標準化されたアッセイを確立する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 顎関節（TMJ）の荷重条件に関する疾患関連モデリングをサポートし、軟骨の変性と修復メカニズムを評価します。
- 運用の価値： マウスモデルにおける構造的適応および細胞応答の縦断的評価を容易にし、前臨床段階での連続性を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、関節組織生物学におけるターゲット選定およびメカニズム的なリスク低減に寄与する、初期段階の構造的・表現型データを提供することで、創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学： 定量可能な形態計測および分子エンドポイントを通じて、軟骨細胞の分化とマトリックス産生の機械的調節に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 下顎顆の寸法と分子マーカーの標準化された放射線学的および組織学的定量化により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析： 条件間の比較分析のため、下顎顆の長さ、幅、Col10a1陽性ピクセル分率、TRAP活性、およびEDU陽性細胞数を含む定量的な測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 機械的負荷を軟骨内骨化領域の組織学的結果に結びつけ、前臨床的な妥当性を裏付けます。
- 企業の再利用： 他の小型動物の骨や骨化部位にも適応可能であり、プロジェクト間での標準化を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：構造的変化を肥大およびリモデリングの分子マーカーと相関させることにより、負荷に対する軟骨応答のメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：標準化されたイメージングプロトコルとソフトウェアベースの定量化により、研究室間での再現性を確保する。
- 戦略的価値：組織適応に関する客観的かつ多パラメータ的なデータを提供することで、ターゲットバリデーションにおける意思決定（go/no-go）を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの前臨床モデルにおける定量的な表現型アウトカムに基づき、メカノバイオロジーターゲットのリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- げっ歯類の解剖、放射線画像撮影、および組織切片作成の専門知識が必要です。
- X線画像診断システム、蛍光顕微鏡、および画像解析ソフトウェア（Digimizerなど）へのアクセスが必須となります。
- 一貫した形態計測および細胞定量化を行うためには、試料調製、包埋、および切片作成プロトコルの標準化が必要です。
- 他の骨部位に適用する場合は、解剖学的指標および関心領域（ROI）の定義を検証する必要があります。
- 実用上の制限として、組織サイズの制約があること、および調製中の脱灰を防ぐために慎重な取り扱いが必要なことが挙げられます。
