時間経過、ラベル無料、定量的相休眠とアクティブなひと癌細胞のイメージング研究

この実験の全体的な目標は、細胞の形態、増殖、および運動性の分析を組み合わせて、体系的な方法でヒト骨肉腫細胞の血管新生および非血管新生表現型を定量的に特徴付けることです。この方法は、ヒトのがんの確立と進行に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。特に、腫瘍休眠からの脱出と内因性スイッチ。

この手法の主な利点は、この統合された高拡散法により、多細胞パラメータを同時に分析できることです。これには、細胞面積、細胞の厚さ、細胞体積、増殖速度、倍加時間、運動速度、遊走、および運動性が含まれます。まず、培地を水浴で摂氏37度に予温します。

次に、血管新生および非血管新生ヒト骨肉腫細胞の極低温バイアルを液体窒素タンクから取り出します。バイアルの底を摂氏37度の水浴に浸し、極低温バイアルを静かに振って解凍プロセスを加速します。細胞が解凍されたらすぐに、バイアルに70%エタノールをスプレーし、バイアルを拭いて滅菌します。

次に、バイアルから細胞懸濁液を直ちに吸引し、10ミリリットルの温めた培地に穏やかに懸濁します。次に、細胞懸濁液を5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。フードに戻り、上清を取り除き、温めた培地10ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。

次に、細胞懸濁液をT75フラスコに移します。細胞懸濁液を数回静かにピペットで動かして、細胞を均一に分散させます。フラスコをインキュベーターに入れ、細胞を少なくとも12時間付着させます。

培地は2〜3日ごとに交換してください。細胞が80〜100%のコンフルエントに達したら、フラスコから培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を洗浄します。次に、0.25%トリップソンEDTA溶液1ミリリットルをフラスコに加え、フラスコを短時間攪拌します。

フラスコを2〜3分間インキュベートしてから、顕微鏡で細胞をチェックし、細胞が丸められて分離していることを確認します。細胞が剥離したら、ピペットを使用して10ミリリットルの培養培地を追加し、培地を数回ゆっくりと上下させて、残っている細胞凝集体を分解します。細胞を数えた後、200万個の細胞を新しいT75フラスコに播種します。

フラスコをインキュベーターに入れ、細胞を80〜100%のコンフルエンスまで成長させてから、定量的位相イメージング実験のために細胞を播種します。トリプソン消化によって細胞を収穫し、ウェルあたり50, 000〜300, 000細胞の密度で6つのウェルプレートに血管新生および非血管新生ヒト骨肉腫細胞を播種します。細胞を合計5ミリリットルの培地で覆います。

その後、プレートを少なくとも12時間インキュベートして、細胞が付着する時間を確保します。イメージングする前に、メディアを新しいメディアと交換してください。カバースリップは、流す脱イオン水で数回すすいで清掃します。

次に、75%エタノール溶液に15分間浸します。滅菌したカバースリップを層流フードに入れて乾かします。次に、カバースリップを6ウェルプレートに慎重に置き、明らかな気泡を避けます。

プレートをインキュベーターに入れて、少なくとも15分間平衡化します。プレートの蓋に霧が発生した場合は、イメージングする前に滅菌綿棒を使用してきれいに拭いてください。定量位相イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化します。

露光時間、パターンコントラスト、ホログラムノイズのセルフキャリブレーションで値が許容できることを確認してください。次に、6ウェルプレートを定量位相像顕微鏡のステージに置きます。ソフトウェアに戻り、[ライブキャプチャ]をクリックします。

次に、ソフトウェアのフォーカスメニューに移動し、[手動]を選択します。次に、顕微鏡設定メニューに移動し、作業距離を調整して細胞の位相像に粗く焦点を合わせ、位相像の細胞の輪郭を取得します。終了したら、ソフトウェアのフォーカスメニューに戻り、フォーカス設定を自動に変更します。

次に、新しい実験をクリックします。マウスまたはテンキーの矢印キーを使用して、画像取得位置の選択を開始します。各選択の後に [記憶] をクリックします。

すべての位置を選択したら、タイムラプスセクションに移動し、イメージング間隔を5分未満で合計時間が48時間になるように設定します。[キャプチャ] をクリックして実験を開始します。これにより、各インターバル時間ポイントで選択した位置に自動的に焦点を合わせ、画像を取得します。

画像取得に続いて、最初に[Identify cells]をクリックして細胞の形態を解析します。背景しきい値の数値設定を調整して、セル領域が背景ノイズから十分に分離されるようにします。次に、オブジェクトサイズの設定数を調整して、各セルの核が1つだけになるようにします。

この要件に一致しないセル セグメントは、手動変更を使用して手動で変更します。次に、ソフトウェアのデータ解析機能を使用して細胞を分析します。新しい分析をクリックして、新しいデータ分析を開始します。

選択した画像をソースフレームタブにドラッグし、セルの面積、光学的厚さ、個々のセルの体積など、セルの形態パラメータを記録します。終了したら、散布図またはヒストグラム モードを選択し、データをテーブルまたは図としてエクスポートします。12時間間隔で少なくとも5つの画像を選択し、ソフトウェアによって提供されるセル番号を記録します。

初期細胞数で正規化し、細胞数をプロットすることにより、細胞の増殖速度を推定します。最後に、指数関数的成長曲線を使用してデータポイントを適合させることにより、倍増時間を推定します。細胞の動きを解析するには、ソフトウェアのトラックセル機能を使用します。

まず、新しい分析をクリックして、新しいデータ分析を開始します。次に、対象の期間から一連の画像をソースフレームタブにドラッグします。次に、セルの追加選択モードで、10〜30個のセルをクリックしてランダムに選択します。

一連の画像のトラッキングを必ず確認してください。システムがセルの追跡を見失った場合、または間違ったセルを追跡した場合は、[識別]をクリックしてセルを識別するか、選択モードに移動して[位置の変更]をクリックしてセルの位置を変更して、追跡セルを手動で調整します。終了したら、移動をプロットしてセル軌跡の行プロットを選択するか、プロット機能に移動して、運動速度、運動性、移動、移動の直接性などの他の運動関連パラメータをプロットします。

データを表または図としてエクスポートします。このプロトコルでは、定量的な位相画像がホログラフとして提示されます。ここに示す細胞は、血管新生および非血管新生のヒト骨肉腫細胞の典型的な細胞形態を示しています。

セルの厚さは、屈折率と光路長によって計算され、ここでは散布図として示されています。2つの異なる細胞表現型は、異なる分布パターンを示し、血管新生細胞が非血管新生細胞よりも細胞面積が小さく、細胞の厚さが大きいことを示しています。2つの細胞タイプの細胞増殖速度は、セグメント化され、2日間にわたるこれらのような2D画像から計算できます。

これらの特定の細胞タイプについては、有意差は認められませんでした。細胞の細胞運動特性を決定するには、個々の細胞を選択し、経時的に追跡する必要があります。ここでは、追跡されたセルは異なる色で囲まれています。

個々のセルは 4 時間にわたって追跡され、ここでは、ゼロ点が開始位置、最終位置が色付きのドットで示されている合計パス軌跡について説明します。このビデオを見れば、定量的位相イメージングを使用して、細胞の形態学的および挙動パラメータを定量的に比較する方法を十分に理解できるはずです。この場合、血管新生細胞表現型と非血管新生細胞表現型の間。

この開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が腫瘍休眠からの脱出とこのプロセスにおける血管新生の役割を探求する道を開きました。連続的で非ラベリングのプラットフォーム。ヒト細胞株の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。