チオバルビツール酸反応性物質アッセイを用いた生体試料における酸化ストレスの評価

したがって、TBARSアッセイは、生物学的サンプルの酸化ストレスの実験室内での一般的な評価に最適であり、保存および処理されたサンプル間で相対的なTBARSレベルを直接比較します。これらのアッセイは、市販のキットが約400サンプルであるのに対し、96サンプルの試験に約3コストと非常に安価で、1バッチのサンプルしか分析できません。ここで説明する方法は、生物試料の安定性研究、および分析前に酸化防止剤または他の種類のサンプル保存剤を添加することが適切または義務付けられているものを含む特定のアプリケーションにさらに適合させることができます。

結果が大きく変動することを避けるために、新しい試薬を準備し、カラー試薬のpHが4を超えていないことを確認し、吸光度を測定する前にニデーゼ膨潤プレートの気泡を取り除きます。チオバルビツール酸の0.8%水溶液を調製することから始めます。4グラムの水酸化ナトリウムビーズを20ミリリットルの水に溶解することにより、5モルの水酸化ナトリウム溶液を調製します。

溶液をプラスチック容器に保管します。バッチごとに作りたてのものでなければなりません。450ミリリットルの脱イオン水に4グラムのチオバルビツール酸を加え、マグネティックスターバーを使用して穏やかに溶解します。

約4ミリリットルの水酸化ナトリウム溶液を100マイクロリットル刻みでゆっくりと加え、チオバルビツール酸粒子が溶解するpHを確認します。.すべての粒子が溶解するまで、水酸化ナトリウムを加え続けます。溶液のpHがpHストリップで4以下であることを確認し、次に脱イオン水で最終容量を500ミリリットルにし、チオバルビツール酸水溶液を室温で保存します。

MDA ビスジメチルアセタール標準曲線溶液を 2 ミリリットルのスナップキャップポリプロピレンチューブで調製します。テキスト原稿に記載されているように、200マイクロモルのストック溶液を水で希釈します。サンプルをボルテックスします。

分析するサンプルのガラス管にラベルを付け、準備したサンプルを各チューブに100マイクロリットル追加します。各サンプルに200マイクロリットルの8.1%SDSを加え、ガラス管を円を描くように静かに渦巻いて混合します。各サンプルに1.5ミリリットルの3.5モル酢酸ナトリウム緩衝液を加え、次に1.5ミリリットルの0.8%チオバルビツール酸水溶液を追加します。

700マイクロリットルの脱イオン水を追加して、各チューブのファイナルを4ミリリットルにします。ガラス管をしっかりと蓋をし、摂氏95度に設定された加熱ブロックで1時間インキュベートします。結露を防ぐためにチューブをアルミホイルで覆い、ブロックからチューブを取り外して氷上で30分間インキュベー

インキュベーション後、サンプルと標準試料を1,500倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。各チューブから150マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移し、ピペットチップで気泡を取り除きます。532ナノメートルでサンプルの吸光度を測定し、他のすべての吸収剤の読み取り値からブランクサンプルの平均吸収剤の読み取り値を差し引きます。

標準曲線を作成し、それを使用して未知のサンプル濃度を計算します。MDA bis ジメチルアセトール標準曲線を作製し、3 つの異なる生体サンプルにおけるアッセイの検出限界と感度、および酸化レベルを決定しました。合計9つのTBARSアッセイを3つのサンプルで異なる日に実施しました。

検出限界を決定するために、ブランクサンプルの吸光度を3つの異なる日に測定しました。検出可能な非ノイズ吸収性シグナルを出すために必要なTBARS物質の最小濃度は1.1マイクロモルです。また、アッセイの感度は、濃度の増加マイクロモルあたり約0.0016吸収剤単位です。

TBARSアッセイは、さまざまな生物学的マトリックスの脂質過酸化の変化を検出するために使用できます。この2つの塩化銅を実証するために、ヒト血清HEPG2細胞ライセートおよび低密度リポタンパク質のinvitro酸化を誘導するために使用しました。EDTAを含むLDLサンプルに対してTBARSアッセイを実施し、銅、処理済み、未処理のLDLサンプル間でTBARSのレベルは変化しませんでした。

しかし、スピンろ過によりEDTAを除去した後、LDLは銅2媒介酸化を受けました。ヒト血清中のTBARSアッセイのダイナミックレンジを示すために、2ミリモル銅2イオンの濃度をサンプルに添加したところ、TBARSが6〜7倍に増加しました。このプロトコールを試みるときは、サンプルを氷上に10分以上放置せず、遠心分離後は室温で放置してください。

もともと収集、処理、および一緒に保存されなかった生物試料のバッチまたはサブセットについては、バッチ効果のデータを統計的に評価して、人工的な酸化が結果に寄与しなかったことを確認する必要があります。低密度リポタンパク質からの意図的な定量化可能な体外酸化により、酸化がその機能生物学にどのように影響するかを理解することができます。