同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

この実験の全体的な目的は、トマト植物におけるレドックス調節タンパク質に対するPseudomonas syringae pv. tomatoの影響を観察することです。まず、トマト植物にPseudomonas syringae pv. tomatoを接種して病原体感染とタンパク質応答を誘導します。続いて、DIAM benzineで染色し、活性酸素種の変化を観察します。

次に、タンパク質中の還元的に調節されたシステインを調べるために、システインのTMT標識を行います。得られた結果により、処理サンプルとコントロールサンプルの間の変化を測定することができます。こんにちは。フロリダ大学生物学部およびプロテオミクス施設のChenです。

同位体コーティングフィンタグ（ASCAとしても知られる）などの既存の手法に対する本CTMTタグ法の利点は、大規模にレドックス応答性タンパク質を分析しつつ、マルチプレックス化が可能である点にあります。本デモンストレーションでは、病原体感染に対するトマトのレドックス調節タンパク質についての知見を提供しますが、この実験手法は、酵母、マウス細胞、その他の植物やストレス条件下での制御などの他のシステムにも適用可能です。利用可能なタグが2種類しかなかったため、ICAD実験間で顕著なばらつきが見られたことから、我々は最初この手法を考案しました。

ラベル付けと濃縮のステップは習得が困難であるため、この手法のVIRデモンストレーションは非常に重要です。効率的なラベル付けを確実にするためには、ラベル付けしたサンプル間の実験的変動を最小限に抑え、除去される領域を減らす必要があります。それでは始めましょう。接種源培養のために、同程度の大きさの移植したトマトの苗2株を直径4インチのポットで育てます。

KBMプレート上のPseudomonas syringaeの菌叢。細菌をスクレイパーでかき取り20 mLの水に懸濁させ、約10⁶ CFU/mLの細菌接種液を調製する。1 Lの接種バッファーを用いて、4週齢の植物をこの細菌接種液に30秒間浸漬させる。

その後、すぐに透明なプラスチック袋で覆います。所定の接種時間後、完全に展開した葉を採取し、表皮側を上にして1 mg/mLのDAB染色液に入れ、15分間真空浸潤させます。その後、葉を室温の暗所で一晩インキュベートします。

次に、染色した葉を95% ethanolで10分間煮沸し、75% ethanol中で保存します。回収した葉を液体窒素中で乳鉢を用いて微粉末に研磨します。その後、付属の本文に記載されている通りにフェノール抽出を行います。

次に、フェノール抽出したタンパク質を、100% methanol中の冷 0.1 molar 酢酸アンモニウム5量分で沈殿させます。遠心分離によりタンパク質を回収し、ペレットの洗浄を行います。その後、サンプルを冷 70% ethanol 1.5 millilitersで再懸濁し、2 milliliter マイクロ遠心チューブに移します。

遠心分離後、エタノール上清を廃棄し、スピードバックを用いてペレットを短時間乾燥させる。変性タンパク質抽出緩衝液でサンプルを溶解させ、遠心分離してペレットを形成させた後、上清を回収し、製造元のマニュアルに従ってタンパク質濃度を測定する。6種類のマス tags のそれぞれについて、100 µg のタンパク質サンプルを用い、遊離チオール基をブロックするために、調製直後の 200 mM IO アセトアミドアルキル化緩衝液を等量加え、37 °C で 1 時間インキュベートする。その後、タンパク質を沈殿させるため、冷えた 80% アセトンを 1 mL 加え、-20 °C で一晩静置する。

遠心分離によりタンパク質をペレット化し、80% アセトンで3回洗浄します。サンプルを氷上で風乾させた後、ペレットを 50 µL の溶解バッファーに再懸濁します。次に、ジスルフィド結合を還元するため、100 mM TCEP を 0.5 µL 添加し、室温で1時間インキュベートします。

試薬チューブに20 µLのアセトニトリルを加え、タグを可溶化させます。ボルテックスし、遠心して液をまとめます。次に、過剰なTCEPを除去するため、50 µLのサンプルをMicroCon 3 KDカラムにロードします。50 µLの溶解バッファーを加え、10,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。

サンプルを回収するには、カラムを取り出して清潔なチューブに逆さに挿入し、遠心分離します。必要に応じてサンプルのpHを確認してください。1 M 塩酸を用いて、pH 7から8の間に調整します。

TMT試薬を5 µL加え、室温で2時間反応させます。サンプルを混合し、等量のサンプルバッファーを加えて5分間煮沸した後、プレキャスト12%ポリアクリルアミドゲルで分離します。ゲルをろ過水で3回洗浄し、クマシーブルーで1時間染色した後、水中で一晩脱色し、タンパク質バンドの濃度を確認します。各ゲルのレーンを12個のフラクションに分割します。各フラクションを1 mm角に切り出し、1.5 mLチューブに入れます。

0.1 M 重炭酸アンモニウムを含む 50% アセトニトリルでゲル片を完全に浸します。次に、100% アセトニトリルでゲル片を 15 分間覆います。液体を除去し、スピードバク（遠心濃縮機）を用いてゲル片を乾燥させます。

次に、同量のトリプシン溶液を加え、氷上に置いて再水和させます。その後、トリプシン消化のため、37 °Cで12〜16時間インキュベートします。続いて、インキュベートした試料から液状のタンパク質抽出物を取り出します。

ゲルピースを5% formic acidおよび50% acetonitrileで覆い、反応を停止させ、残存するタンパク質消化物を除去します。その後、室温で20分間ゲルピースを振盪します。さらに2回抽出を繰り返し、上清をタンパク質抽出サンプルチューブに移します。

0.5 milliliterチューブを用いて、スピードバクでサンプルを乾燥させます。それぞれのタンパク質バンドの強度に比例した濃度で、TBSを用いてanti TMTレジンの50%スラリーを調製します。1倍量のTBSを用いてレジンを3回洗浄した後、各サンプルに200 microlitersのTBSを加えます。

その後、anti TMT resinに移し、室温で2時間攪拌し、続いて4°Cで一晩ロッキングします。各サンプルをカラムにロードします。200 µLずつカラム洗浄を行います。

次に、各サンプルを200 µLの50%溶出バッファーで3回溶出し、真空状態で乾燥させます。その後、サンプルを0.1%ギ酸を含む3%アセトニトリル12 µLに懸濁させ、5 µLをHPLCカラムに直接注入します。付属のテキストに詳述されている通り、アセトニトリルの濃度を上げるグラジエントを用いてペプチドを溶出させます。

質量分析を用いて、トップ2×3ワークフローでペプチドを検出します。まずシングルステージMSから開始します。次に、高エネルギー衝突解離（HCD）フラグメンテーションによる3つのMS/MSスペクトルを取得し、それに続いて3つのスペクトルを取得します。

タンパク質同定のための衝突誘起解離を用いたMs.MS。分岐ワークフローを用いて質量分析データを解析します。比率を定量化するために、レポーター鉄定量化ツールを実装します。

また、MSM MSスペクトルをスペクトルセレクター、スペクトルノーマライザー、およびスペクトラムグルーパーノードで処理し、SeaQuest検索エンジンに対してデータを照会します。この画像は、DABで染色した後の、左側の対照群のトマト植物の葉と、右側のPseudomonasを接種した葉の例を示しています。DES染色プロセスにより、組織化学的染色を用いて葉組織内の活性酸素種の兆候を可視化することができます。

予想通り、コントロールでは有意な染色は見られませんでしたが、pseudomonasで処理した葉では過酸化水素の産生に対して陽性に染色されました。この例はプロテオーム解析のデータ出力を示しており、各サンプルの酸化還元調節を受けたタンパク質のピーク面積により絶対定量が可能になります。コントロールと接種サンプルの間のピーク面積は、相対量を示しています。

ここでは、対照群と接種サンプルの間におけるタンパク質の還元制御は同様です。強度が同程度のピークは、処理による変化で制御されていないジスルフィド結合の存在を示唆しています。この技術を習得すれば、1週間で適切に実施することが可能です。

サンプルは常に低温に保ち、ラベルを整理しておくことを忘れないでください。また、フェノールを使用する際は、適切な手袋を着用し、本手順に従ってドラフト内で作業するなど、予防措置を講じてください。また、オレイン酸やグルタチオン S-シルートランスフェラーゼなどの他のシステム修飾を特定するために、翻訳後修飾の特異的な質量分析などの他の測定を行うことも可能です。

このビデオを視聴することで、DIBスタンディングCTMDの有効化およびredox 16クオリフィケーションの実施方法について十分に理解できるはずです。