動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

このサルモネラLAMP法は、動物性食品のスクリーニング方法および推定サルモネラ菌分離株の確認方法として、FDAの細菌学的分析マニュアルに組み込まれています。この方法は、迅速で信頼性が高く、堅牢です。PCRと比較すると、その主な利点は、迅速な検査、シンプルな機器化、低い偽陰性率、柔軟なワークフローなどです。

サルモネラ菌などの病原体の迅速なスクリーニングは、汚染された可能性のある製品を迅速に検出する上で重要な役割を果たし、人間や動物の病気や発生を防ぐことができます。まず、LAMPアッセイ用のDNAテンプレートを調製します。DNAテンプレートの作成に使用されるサンプルには2つのタイプがあります。

動物性食品サンプルからテンプレートを調製するには、25 グラムの食品サンプルを無菌フィルターバッグに無菌的に計量します。225ミリリットルの滅菌緩衝ペプトン水をバッグに加え、摂氏35度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、バッグのろ過側から1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移します。

チューブをGの900倍で1分間遠心分離します。次に、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを 16, 000 倍 G で 2 分間遠心分離します。

そして、上清を捨てるには、ペレットを100マイクロリットルのサンプル調製試薬に再懸濁し、乾燥熱ブロックで摂氏100度で10分間加熱します。その後、サンプルを室温まで冷却し、マイナス20°Cで保存します。このLAMPアッセイの2番目のタイプのサンプルは、推定サルモネラ菌培養物から直接採取されます。

DNAテンプレートを調製するには、500マイクロリットルのサルモネラ菌培養物を一晩かけてマイクロ遠心チューブに移し、摂氏100度のヒートブロックで10分間加熱します。その後、サンプルを室温まで冷却し、マイナス20°Cで保存します。クロスコンタミネーションを防ぐために、LAMPマスターミックスの調製とDNAテンプレートの添加に使用する領域を物理的に分離してください。

イソプロパノールとDNAおよびDNAの分解液で作業面を洗浄します。次に、ピペットとチューブストリップホルダーを清掃します。等温Master Mix、10X Primer Mix、分子グレードの水、ポジティブコントロールDNA、DNAテンプレートを室温で解凍します。

LAMP機器の電源を入れ、関連するファイル情報を入力します。原稿の指示に従ってLAMPマスターミックスを調製し、短時間ボルテックスして遠心分離し、23マイクロリットルのマスターミックスをチューブストリップの各ウェルに分配します。すべてのDNAテンプレートをボルテックスし、短時間遠心分離します。

次に、2マイクロリットルのDNAテンプレートを適切なウェルに加え、ウェルにしっかりとキャップをします。チューブストリップをホルダーから取り外し、フリックして、すべての試薬がチューブの底に溜まっていることを確認します。チューブストリップをLAMP装置にロードし、LAMPランを開始します。

LAMP反応の進行中に、「Temperature」、「Amplification」、および「Anneal」タブをタップすると、LAMP実行中のさまざまなパラメーターの動的変化を確認できます。LAMPの結果は、LAMPインストルメントパネルにリアルタイムで表示することも、LAMPソフトウェアを使用して表示することもできます。インストルメントパネル上で結果を解釈するには、対象のLAMPランを開きます。

各実行に関連付けられている 5 つのタブを確認します。「Profile」タブと「Temperature」タブには、LAMP反応の進行に伴うサンプルウェル内のプログラムされた温度と実際の温度が表示されます。AmplificationタブとAnnealタブには、AmplificationフェーズとAnnielフェーズ中の蛍光の読み取り値と蛍光の変化がそれぞれ表示されます。

「結果」タブには、原稿の指示に従って解釈できるLAMP結果の表形式ビューが表示されます。LAMPの結果を表示する2つ目の方法は、LAMPソフトウェアを使用することです。ソフトウェアで結果を解釈するには、左側のパネルの[コンピューター]アイコンをクリックし、目的のLAMP実行をロードするファイルの場所に移動します。

各実行に関連付けられている 7 つのタブを確認します。「Profile」タブと「Temperature」タブには、LAMP反応の進行に伴うサンプルウェル内のプログラムされた温度と実際の温度が表示されます。「Amplification」タブと「Amplification Rate」タブには、Amplificationフェーズ中の蛍光測定値と蛍光の変化が表示されます。

「Anneal」タブと「Anneal Derivative」タブには、アニール期の蛍光測定値と蛍光の変化が表示されます。[結果] タブには、LAMP の結果が表形式で表示されます。グラフ名、ウェル番号、ウェル名、ピーク値の 4 つの列があります。

8つのサンプルすべてのアンペア時間とアニール微分が表示されます。結果は、原稿の指示に従って解釈することができます。LAMPインストゥルメントパネルとLAMPソフトウェアを使用して、アッセイの結果を表示することができます。

このLAMPランでは、サンプルS1からS6は、Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741の10倍の段階希釈であり、反応ごとに110万から11コロニー形成単位の範囲です。ポジティブコントロール(PC)は、反応ごとに17, 000コロニー形成ユニットのサルモネラ菌腸炎チフス菌LT2であり、テンプレートコントロールなし(NTC)は分子グレードの水です。NTC井戸のLmaxとAnear温度は、LAMPインストルメントパネルに約81°C、LAMPソフトウェアではTmaxとAnear温度が空白です。

ポジティブコントロールウェルのTmaxは7分45秒で、アニーリング温度は両プラットフォームで約90°Cです。サンプルS1からS6のTmaxは6分から30秒、12分15秒で、アニーリング温度は約90°Cで、すべて陽性の検出を示しています。LAMPは非常に効果的で、大量のDNAを生成します。

そのため、クロスコンタミネーションを防ぐために、ラボのベストプラクティスを使用することが重要です。DNAテンプレートを作成する際には、汚染された動物性食品からの濃縮物にはサルモネラ菌が多く含まれる可能性があるため、同様の方法を使用してください。LAMP陽性の動物性食品サンプルスクリーニングは、FDAの細菌学的分析マニュアルの手順に従って培養分離することにより確認する必要があります。

陰性サンプルは、そのように報告できます。このLAMP法がFDAの細菌分析マニュアルに組み込まれたことで、この迅速で堅牢でユーザーフレンドリーな技術を食品安全性試験に広く適用できるようになります。