粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

この手順の全体的な目的は、生鮮農産物の粘着テープによるサンプリングと、迅速蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いたサルモネラ属菌の全細胞分子検出を組み合わせることにあります。これは、まず目的の材料に粘着テープを貼付して表面に付着した細胞を採取することで達成されます。細胞が付着したテープは、そのまま直接分析するか、あるいは固相または液相での増菌処理に供することができます。

手順の第2段階は、液体培地中で導入または濃縮された細胞を対象とした、テープ上での固定およびエタノール系列による脱水です。第2段階では、懸濁状態での細胞固定を行い、続いて保存バッファーで細胞を再懸濁させます。手順の第3段階では、サルモネラ特異的なオリゴヌクレオチドプローブカクテルを用いてテープ上での迅速なハイブリダイゼーションを行い、次いで洗浄バッファーでのリンスにより過剰なプローブを除去します。FISH法で解析するサンプルの場合、FISHステップは懸濁状態で実施し、解析前に単純な希釈操作によって過剰なプローブを除去することが可能です。

本手順の最終ステップは、ハイブリダイゼーション後のテープ捕捉細胞をDPIで対比染色し、蛍光顕微鏡で観察することです。事実に基づく解析を行う場合は、対比染色は不要です。最終的に、この手法は、採取した生鮮農産物に存在する可能性のあるサルモネラ属種を、視覚的またはサイトメトリー的に検出するための手段を提供します。

この手法を最初に思いついたのは、ローマ時代のエアロストーンの遺物上の細菌コミュニティを調査するために同様のアプローチを用いていたイタリアの研究グループについての論文を読んだときでした。その後、私とrは、私が担当していた食品微生物学の迅速法に関する講義でこの研究について議論しました。それから数週間後、生鮮農産物が原因とされるサルモネラ菌の集団感染が発生し、最終的に43州で約1500人が罹患しました。

本実験手法は、生鮮農産物上の特定の細菌種を検出するためのタイムリーかつ実用的な手段を提供するだけでなく、ポータブルであるため、フィールドや食品生産環境での検査も可能です。まず、サンプリングに使用するテープを選択します。市販の菌類用テープやコンタクトテープなど、滅菌済みで使いやすくパッケージ化された選択肢があります。

滅菌済みのアルミニウム製テンプレートを使用し、10 cmの粘着テープの非粘着側に、油性マジックで1 cm四方の正方形を描きます。これは、テープのどの部分が食品または環境表面のサンプリングに使用されたかを記録するための視覚的なガイドとして機能します。粘着面をサンプリング対象の表面に向けたC字型のテープループを作成します。具体的には、親指と中指で粘着端を持ち、人差し指をテープ背面にある描いた正方形に当てて固定します。

サンプリングする表面にテープを置き、テープの端を離さないように、印を付けた部分を表面にそっと押し付けます。人差し指を使用して、テープの粘着面がサンプル表面に完全に密着するようにします。均一に動かし、気泡が入らないようにしてください。

サンプルからゆっくりとテープを引き剥がします。表面に結合した微生物を物理的に抽出することで、細胞の捕捉を確実に行います。一般的な透明な事務用テープを使用し、テープに適切な張りと伸びを持たせて、しわのない平坦な表面になるようにしてガラス製顕微鏡スライドの上に粘着面を上にして貼り付けます。

これにより、その後の加熱工程におけるテープの変形や丸まりによる問題を最小限に抑えることができます。ハイブリダイゼーションの間は、サンプリングした細胞がアガロース表面に直接接触し、後でテープをアガロース表面から簡単に剥がせるように、テープを裏返してxylose slicing tertile fourまたはXLT fourアガロースプレートの上に置いてください。

濃縮後、テープのテンプレートサンプル接触部分をagri表面に密着させ、テープの一端を軽く貼り付けます。結露を防ぐため、シャーレの側壁を逆さまにして35 °Cで培養します。Salmonella属の十分な増殖を可能にするため、細胞を検出可能なレベルまで濃縮するために必要な培養期間は、初期のSalmonella汚染レベルによって異なります。

所定の濃縮期間後、アガロースプレートを開けます。テープは培養中も粘着性を保持しています。テープとアガロースの界面に形成されたマイクロコロニーを最大限に回収するため、人差し指でテープをアガロースに軽く押し付けます。ペトリ皿の壁面に固定されている端からテープを掴み、ゆっくりと均一な動作で剥がします。一般的な透明オフィス用テープを使用して、セルチャージテープの粘着面を上にして顕微鏡スライドに貼り付け、しわのない平坦な表面を作成します。

サンプルの接触領域を500 µLの10%中性緩衝ホルマリンで覆い、25 °Cで30分間、テープ上の細胞固定を行います。刺激性または毒性のある蒸気への曝露を最小限に抑えるため、固定液は化学フード内で密閉容器に廃棄し、テープ表面に1 x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を穏やかに注いで1回洗浄し、サンプルを脱水させます。段階的なエタノール系列を用いて、市販の分子生物学グレードの溶液を使用してプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄バッファーを調製し、0.22 µmのシリンジフィルターでろ過した後、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーを55 °Cに予熱します。

あらかじめ加熱したハイブリダイゼーションバッファーに蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを加え、最終プローブ濃度を5 ng/µLにします。プローブカクテルを含むハイブリダイゼーションバッファー300 µLを、テープ上のテンプレートサンプル接触領域に重なるように加えます。ハイブリダイズさせたテープ結合細胞を、55 °Cに設定した湿潤密閉インキュベーションチャンバーに入れ、スライドモード搭載機器などの直接接触式インキュベーターで15分間ハイブリダイゼーションを行います。ハイブリダイゼーション後、スライドを取り出し、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイを除去します。ピペッティングにより、あらかじめ加熱した洗浄バッファーで短時間かつ穏やかにすすぎます。

傾斜させたスライド上の少量のバッファーにより、スライドを自然乾燥させ、蛍光顕微鏡を用いてSalmonella属菌を検出します。DPI（核対比染色剤）を含む封入剤のVector Shield H 1200を約10 µLスライドに滴下し、暗所で10分間インキュベートします。カバーガラスに浸油を滴下し、高倍率の油浸対物レンズを用いてサンプルを観察します。

サンプルのフォーカス合わせにはDPIフィルターを使用します。その後、顕微鏡を適切なフィルターに切り替え、プローブの標識に使用した染料に応じて、サルモネラ細胞の緑色または赤色の蛍光に基づいて視覚的にカウントします。フローサイトメトリーによる検出を行う場合は、PBS懸濁サンプルを5 mLのラウンドボトムサンプリングチューブに移し、励起波長 647 nm のフローサイトメーターを用いて解析します。

FlowJoソフトウェアを用いてデータを解析します。人工的に汚染させたトマトの表面から、terica serovar, Ty Muriumを粘着テープでサンプリングすることで、顕微鏡観察またはフローサイトメトリーによる細胞充填を用いた直接的な事後解析が容易になります。テープは、Salmonella特異的DNAプローブとTexas Redで標識したものの組み合わせを用い、テープ上のSalmonella細胞の初期局所濃度に応じて、迅速な蛍光in situハイブリダイゼーションのために処理されました。

固相濃縮の結果は、単離されたマイクロコロニーからコンフルエントな増殖まで多岐にわたりました。テープでサンプリングした細胞は、サンプリング直後、または5時間の液体表面培養後に、FISHとフローサイトメトリーを組み合わせて解析することができました。35 °Cでミニカルチャー濃縮を行いました。

食品安全におけるテープフィッシュ法の利用について記述しましたが、本手法は環境微生物学、植物病理学、または臨床微生物学を含む他の分野でも活用できる高いポテンシャルを有しています。本手順と並行して、テープで抽出したサンプルの固相または液相増菌物を用いて、生化学的試験やPCRなどの追加実験を行うことができます。これらの試験を用いることで、フィッシュ法の手順では範囲外となる、存在し得るsalmonellaに関する疑問を解決することが可能です。