マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離
2020年4月29日
提示は、マイクロベシクルおよびエキソソームの効果的な濃縮および分離のための紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルです。
このプロトコルでは、細胞外小胞を分離して効果的な濃縮のために設計されたXO Padと呼ばれる紙ベースのデバイスを製造する簡単な方法を説明する。XO Padは、従来の方法よりも高い回収率を示しながら、化学物質や作業機械を使用せずに細胞外小胞を事前濃縮し、単離することができるシンプルなデバイスです。まず、印刷する領域をプリンタ ソフトウェアで定義します。
設計は、円形のサンプル領域の直径が徐々に5ミリメートルから2ミリメートルに狭い12のワックスパターンの層を持っている必要があります。次に、セルロース紙の両側の指定領域に疎水性ワックスを印刷する。ワックスプリント紙を120°Cで80秒間実験室のオーブンに入れ、ワックスプリント紙をカッターで切って個々のXOパッドデバイスを作ります。
5マイクロリットルと2マイクロリットルのパーマ選択的膜を、最も左と右のほとんどの層のサンプル領域にそれぞれ落とします。パーマ選択膜でコード化された層をホットプレートの上に摂氏70度で30分間置き、溶媒を蒸発させます。次に、緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。
XO Pad デバイスを白線に沿って前後に折り、すべてのサンプル領域を収束的に接続します。収束サンプル領域のミクロベシクルおよびエキソソームサンプルのピペット15マイクロリットルを、完全な湿潤を確実にするために数秒待ちます。XOパッドの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでしっかりとクランプします。
0.1X PBSの110マイクロリットルでチャンバーを充填し、2つの銀電極を挿入します。次に、電流電圧源測定システムを使用して、30ボルトを電極に20分間塗布します。濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを分離するには、折り畳まれたXOパッドをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮された粒子を他の層から分離します。
マイクロベシクルとエキソソームが下流解析のために濃縮されるレイヤー 8 と 9 のサンプル領域をパンチアウトします。蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移行アッセイを実施し、濃縮粒子の最大回収のための動作時間を最適化した。全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアで定量化した。
濃縮プロセスの前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、強度の緩やかな減少を伴うすべてのサンプル領域に分散した。10分間の処理の後、粒子は電気キネテニックに移動し、即刻の事前濃度プラグが層7に現れた。20分に達すると、マイクロベシクルとエキソソームは8層と9層に強く焦点を当て、蛍光強度に基づいて5倍に濃縮された。
8層の濃縮された微小胞およびエキソソームの完全性をSEMで調べた。濃縮された微小胞およびエキソソームのサイズ分布も分析した。
続いて、6層、8層、10層のサンプル領域上の濃縮された微小胞およびエキソソームの実際の濃度を分析した。層8では、ミクロベシクルとエキソソームは5.58倍の予め濃縮されたが、他の層では顕著な前濃度は認められなかった。この手順の再現性を確保するために、デバイス検証時およびデバイスの動作時間が最適化された条件であるため、オーブンインキュベーション時間と温度のプロトコルに正確に従った。
XOパッドは、炭酸塩バッファーを使用して、血清や血漿などのタンパク質が豊富なサンプルから細胞外小胞を分離および分離するためにも使用できます。このプロトコルは、診断、薬物送達、免疫療法、および他の治療などの臨床研究に必要な濃縮および分離機能を備えた効率的で簡単な準備ツールを提供することができます。
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概要
本記事では、細胞外小胞の効果的な濃縮および単離のために設計された、XO Padと呼ばれるペーパーベースのデバイスを作製するためのプロトコルを紹介します。XO Padは、化学薬品や装置を使用せずに事前濃縮および単離を可能にし、従来の手法よりも高い回収率を示すことを実証しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 細胞外小胞
背景
- 細胞外小胞は、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。
- これらの小胞を単離するための従来の手法は、複雑な手順を伴うことが多いです。
- XO Padは、研究者に、より簡便な代替手段を提供します。
- 回収率を高めることで、細胞外小胞の研究を促進することが可能です。
研究目的
- マイクロベシクルおよびエクソソームを単離するための簡便な方法を提供すること。
- 既存の技術と比較して回収率を向上させること。
- 細胞外小胞生物学の研究を促進すること。
使用方法
- 12層のワックスパターンを用いたXOパッドの設計。
- セルロースペーパーへの疎水性ワックスの印刷。
- ラボ用オーブンでの印刷済みペーパーの加熱。
- ワックス印刷済みペーパーを個別のXOパッドデバイスに切り出し。
主な結果
- XO Padは、細胞外小胞を効果的に濃縮および単離します。
- 従来の手法よりも高い回収率が実証されています。
- 化学物質を必要としない簡単な作製プロセスです。
- 研究における幅広い応用の可能性があります。
結論
- XO Padは、細胞外小胞を研究する研究者にとって価値のあるツールです。
- これにより、分離プロセスが簡素化されるとともに、効率が向上します。
- この手法は、細胞外小胞の機能に関する理解を深めることができます。
よくある質問
業界における重要性
従来の抽出法は回収率が低く、サンプルを損傷させるため、細胞外小胞の単離はバイオマーカー探索におけるボトルネックとなっていました。ペーパーベースのExo-PADは、化学物質を使用せずにマイクロベシクルおよびエクソソームを5倍に濃縮することができ、小胞の完全性を維持しながら回収率を向上させます。これにより、ダウンストリームのオミクス解析や機能解析に向けたスケーラブルで再現性の高いワークフローが提供され、初期段階のターゲットバリデーションおよびアッセイ開発が促進されます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：濃縮されたベシクルカーゴの解析を通じて、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：超遠心分離法と比較してサンプルの損失と損傷を低減し、ターゲットのリスク低減に利用可能な材料を増加させる。
- 予測的価値：5倍の濃縮により、低発現バイオマーカーのシグナル検出能が向上し、ポートフォリオの優先順位付けの決定を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アッセイの標準化に適した、標準化され濃縮されたベシクル調製物を生成する。
- 運用上の価値： 遠心分離機や化学薬品の必要性を排除し、ワークフローを簡素化して運用の複雑さを軽減する。
- 拡張性： ペーパーベースの設計により、並行処理および複数のサンプルタイプにわたるプラットフォームの再利用が可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳の継続性：濃縮されたベシクルは完全性を維持しており、後続の機能解析やバイオマーカープロファイリングに適しています。
- 疾患関連システム：炭酸緩衝液と併用することで、血清や血漿などの生物学的流体にも対応しており、臨床的妥当性を支持します。
- メカニズムのリスク低減：信頼性の高い単離により、前臨床モデルにおけるベシクル介在性メカニズムの一貫した評価が可能になります。
パイプラインおよびワークフローの統合
Exo-PADは、仮説検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合し、分析および機能的なダウンストリームアプリケーションに向けた信頼性の高いベシクルの調製を可能にします。
- ディスカバリーバイオロジー：カーゴ解析およびパスウェイ解析のための完全な小胞を提供し、標的の機能的なバリデーションを支援します。
- スクリーニング：アッセイへの適用や化合物スクリーニングキャンペーンに不可欠な、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：蛍光ベースの定量化および粒度分布解析を可能にし、条件間の比較評価を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：小胞の構造と機能を維持することで、ディスカバリーから前臨床バリデーションまでの継続性を促進します。
- エンタープライズ再利用：作製と操作が簡便であるため、チームやプロジェクトを跨いで再利用可能なプラットフォームとして導入できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 回収率の向上と完全な状態でのベシクル単離により、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 濃縮プロセスを標準化し、試薬の廃棄を削減し、装置への依存性を排除する。
- 戦略的価値： バイオマーカー検出における偽陰性を減らすことで、go/no-go判断の質を高める。
- ポートフォリオへの影響： 診断および治療への応用に向けた、信頼性と拡張性のあるベシクル調製を可能にし、リスク調整済みの開発推進を実現する。
実施上の考慮事項
- デバイス作製には、ワックスパターニングおよびイオン濃度分極の原理に関する専門知識が必要です。
- 操作には、ラボ用オーブン、ホットプレート、カッター、および電圧源へのアクセスが必要です。
- ユーザー間でサンプル量、バッファー組成、および処理時間を標準化する必要があります。
- 粘性の高い生体流体に適応させるには、炭酸塩による血清/血漿との適合性など、バッファーの最適化が必要な場合があります。
- 実用上の制限：濃縮は層特異的（第8～9層）であるため、下流分析には精密なパンチングが必要です。
