浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析
2022年1月12日
浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。
このアッセイにより、学生はビーズを異なる胚領域に移植することによって、細胞分化や形態形成などの多くの発生過程において特定の分子を見ることができます。このプロトコールは、任意の実験動物モデル、細胞培養、オルガノイドを含むオルガノタイプモデルに適用することができる。さらに、基本的な発生生物学を学生に教えるための有用な教育ツールです。
手順を実演するのは、研究室の学部生であるAlexandra Gonzales-Gonzalesです。まず、受精した白いレグホーン鶏の卵を、摂氏38度、相対湿度70%の加湿インキュベーターで尖った側面を下にして垂直に孵化させます。ハンバーガーとハミルトンによると、彼らが28番目の段階に達したら、インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールと交換して風乾させます。
その後、作業領域、顕微鏡、器具を70%エタノールで消毒します。次に、卵をろうそくで血管を識別し、胚を見つけます。胚を持たない卵子を捨てる。
歯のない鉗子の端を使って、卵の鈍い端をタップして窓を開き、1平方センチメートルの殻の部分を取り除きます。次に、卵をカートンまたはプラスチックホルダーに移し、実体顕微鏡の下に置きます。細かい外科用鉗子を使って、胚に接触する可能性のある卵殻の小さな部分を取り除き、それを穿刺して引き抜くことによって空気膜を除去します。
次に、細かい外科用鉗子を使用して、羊膜袋をわずかに引き裂き、絨毛膜の血管系を傷つけないように注意する。胚をin-ovoでステージングして、それらが所望のステージにあるかどうかを判断する。アフィゲルヘパリンビーズ調製のために、正方形のパラフィルムセクションを45ミリメートルのペトリ皿に収まるように切断する。
パラフィルムをペトリ皿の底に横切って置いた後、歯のない鉗子の端を使用して、各頂点を押して皿の底に固定する。次に、ピペットまたはヘラを用いて、ビーズをマイクロ遠沈管に移し、上清を沈降させてピすることにより、PBSで2回洗浄する。次いで、マイクロピペットを用いて、40〜50個のビーズをパラフィルムで覆われたシャーレの中心に移す。
顕微鏡下で、直径100マイクロメートルのアフィゲルまたはヘパリンビーズを30個選択します。ビーズのサイズは、28段階の胚の3桁目間を基準として用いた。ビーズは桁間よりも小さくなければなりません。
選択したビーズを取り囲む余分なPBSを慎重に除去した後、それらを2〜5マイクロリットルの処理溶液に浸します。ビーズを溶液中で室温で30分間インキュベートする。インキュベーション中、ビーズが乾燥するのを防ぐために、ビーズの周りに数滴のPBSまたは水をピペットでピペットして局所的な雰囲気を加湿し、蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆う。
AG1X2ビーズ調製物を注ぐ。ヘラを使用してビーズをマイクロ遠沈管に移し、50マイクロリットルの処理溶液を所望の最終濃度で加える。チューブをホイルで包んで光から保護した後、ゆっくりと振とうしながらビーズを20分間インキュベートします。
インキュベーション後、ピペットを用いて、0.2%フェノールレッドを水に溶解した染色液中のできるだけ多くの処理溶液を、渦中で穏やかな攪拌で2分間除去する。染色後、色素を除去し、次いでビーズをPBSで2回洗浄して、残留色素を除去した。次に、マイクロピペットチップを用いて、40〜50個のAG1X2ビーズをパラフォームで覆われたペトリ皿の中心に移し、ビーズを5マイクロリットルのPBSに浸す。
次に、顕微鏡下で、直径100マイクロメートルの大きさのビーズを約30個選択します。選択したビーズを実験溶液にビーズの周囲に数滴のPBSまたは水で沈め、局所大気を加湿する。蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆う。
胚を操作する前に、2つの実体顕微鏡をベンチトップに隣り合わせに配置します。次に、歯のない鉗子を使用して、残りの卵に窓を作ります。次に、顕微鏡下で、右後肢近くの羊膜を微細な外科的鉗子で引き裂く。
微細な鉗子を用いて、胚を羊膜で保持し、右後肢を露出させる。次に、細かいタングステン針を用いて、後肢の3桁目の桁間距離の遠位に穴を開ける。胚および露出した後肢を放出することなく、鉗子の先端の1つを使用して、他方の顕微鏡から一方の処理ビーズを採取する。
1つのビーズがその先端に付着するためには、鉗子が開いている必要があります。ビーズを後肢近くのひよこの胚に移し、桁間孔の上に配置します。ビーズが穴に入るまで鉗子を閉じてビーズに圧力をかけます。
その後、胚を解放し、卵殻の窓をテープで密封し、必要な段階に達するまで卵をインキュベーターに戻します。アッセイの有効性を確保するためには、ビーズを一貫して正確な場所に配置する必要があります。この研究では、浸したビーズを頂端外胚葉隆起の下の3桁目間距離に配置した。
胚をオーシャンブルーとアリザリンレッドで染色して、骨格要素の形成を証明し、細胞分化への影響を評価することができます。このアッセイは、ニュートラルレッドおよび遺伝子調節による細胞死の評価にも適しており、C2ハイブリダイゼーションを購入します。この実験ツールの主な利点は、浸したビーズの時間と場所を制御することです。
コアポジショニングと正確な発生タイミングを組み合わせることで、細胞分化プロセスを研究するための大きな可能性がもたらされます。
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概要
浸漬ビーズアッセイを用いることで、細胞分化や形態形成を調べるために、さまざまな発生段階で試験試薬を標的に届けることが可能になります。このプロトコルは、ニワトリ胚を含むあらゆる実験動物モデルに適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 発生生物学
- 細胞分化
- 胚発生学
背景
- 浸漬ビーズアッセイは、発生過程に関与する特定の分子を研究するための手法である。
- この手法は、器官型モデルやオルガノイドを含む様々な実験モデルに適用可能である。
- 本手法は、発生生物学における基本概念を教えるための教育ツールとしても活用される。
- 手順のデモンストレーションは、学部生によって行われる。
研究目的
- 細胞分化および形態形成の調節について探究すること。
- 浸漬ビーズの調製および移植に関する詳細なプロトコルを提供すること。
- 発生生物学における教育的体験を向上させること。
使用した手法
- 加湿環境下での受精鶏卵の孵化。
- 移植用浸漬ビーズの調製。
- 胚の特定領域へのビーズの移植。
- 移植後の発生プロセスの観察。
主な結果
- 本アッセイにより、試験試薬が細胞分化に及ぼす影響を正常に実証できます。
- 胚における形態形成プロセスの知見を得ることができます。
- 本プロトコルは、さまざまな動物モデルに適応可能です。
- 学生は、発生生物学の手法に関する実践的な経験を積むことができます。
結論
- 浸漬ビーズアッセイは、発生生物学を研究するための汎用性の高いツールです。
- この手法は、複雑な生物学的プロセスの理解を促進します。
- 本手法は、教育現場においても効果的に活用できます。
よくある質問
産業界における重要性
浸漬ビーズアッセイは、胚モデルにおけるモルフォゲンや候補分子の正確な空間的・時間的な送達を可能にし、初期創薬におけるメカニズムのデリスキングおよびターゲットバリデーションを支援します。局所的な微小環境を制御することで、この手法は細胞運命の決定、形態形成、およびパターニングに関する実用的な知見を提供し、創薬パイプラインの重要な変曲点における予測の信頼性に直接的に寄与します。さまざまなモデルシステムへの適応性は、ポートフォリオ全体のトランスレーショナルな連続性を高め、発生ターゲットに対する堅牢な仮説検証をサポートします。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 制御されたin vivoの条件下で、モルフォゲン駆動の経路および細胞運命決定の解析を可能にします。
- 特定の分子が組織パターニングに及ぼす影響を分離することで、候補ターゲットの機能的検証をサポートします。
- 局所的な摂動後の発生結果を直接観察できるため、メカニズムのリスク低減を促進します。
- 胚発生における遺伝子またはタンパク質の機能について、仮説駆動型の検証を行うためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- バイオアクティブ化合物または生物学的製剤の下流スクリーニングに向けて、検証済みの胚システムを調製します。
- 局所的な分子送達に応答した表現型変化の、再現性のある定量的な評価を可能にします。
- 正確なビーズ配置と発生段階の設定により、アッセイの標準化をサポートします。
- 他のモデル生物や器官形成システムへのスケーラブルな適応が可能です。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 発生学的表現型を疾患関連パスウェイと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を可能にします。
- 探索段階のメカニズム研究から前臨床モデルでの検証までの一貫性を提供します。
- 候補分子が組織形成に及ぼす機能的影響を明らかにすることで、リスク調整済みの進展判断を可能にします。
- 発生医学および再生医学プログラムにおける予測的なリスク低減をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、初期探索とリード化合物同定のインターフェースとして機能し、仮説駆動型のターゲット検証と胚モデルを用いた表現型スクリーニングを橋渡しするものです。
- 探索生物学： モルフォゲンの局所的な導入と効果の観察を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物やタンパク質の評価に向けて、再現性のある定量的な表現型アウトプットを提供します。
- 分析： 比較分析のための細胞分化、パターニング、および形態形成結果の測定を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 発達生物学的な知見を、前臨床モデルシステムや潜在的なバイオマーカーの同定へと結びつけます。
- 企業内での再利用： ポートフォリオ全体における多様な発生学的およびメカニズム的研究に活用できる、再利用可能で適応性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 開発ターゲットのバリデーションにおける予測信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 開発アッセイのための標準化され、再現性があり、拡張可能なワークフローを提供します。
- 戦略的価値： 生物学的リスクを早期に明確化することで、go/no-goの意思決定および資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 開発および再生プログラムのリスク調整後の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 発生学、発生生物学、および精密なマイクロサージェリー操作に関する専門知識が必要です。
- 実体顕微鏡、制御可能なインキュベーター、およびビーズ調製インフラへのアクセスが必要です。
- ビーズの配置、発生段階の判定、および表現型評価について、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな動物モデルや臓器型システムに適応可能です。
- 制限事項として、ビーズ配置における技術的なばらつきや、正確な発生タイミングの把握が必要であることが挙げられます。
