クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

この手順の全体的な目的は、神経堤細胞の移動と運命を追跡するために、段階を合わせたニワトリ胚にウズラ胚の背側神経管外植片を移植することです。まず、ホストとなるニワトリ胚のIGN膜に小さな穴を開けて神経管にアクセスします。次に、ドナーとなるウズラ胚を卵から取り出し、移植片の切除準備を行います。

次のステップでは、ホスト胚の神経管から目的の領域を切り出します。同様に、グラフト（移植片）としてドナー神経管から同様の領域を切り出します。次に、ドナー神経管をホスト神経管に移植します。

最後に、キメラ胚を目的の段階まで培養し、選択した器官に到達した神経堤細胞を検出します。最終的に、ドナー由来の神経堤細胞がホスト胚のさまざまな部位へ遊走し、分化した様子を免疫蛍光顕微鏡によって可視化できます。マイクロダイセクションおよび移植の手順には非常に精密な運動技能が必要であり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

まず、ぬるま湯でヒヨコ卵の汚れを洗い落とします。卵をトレイに水平に並べ、胚が位置する領域を示すために、上を向いている面に鉛筆で印を付けます。ドナー胚のX ovo調製を行う場合は、ウズラの脚側を下に向け（鈍角側を上にし）してインキュベートしてください。

次に、卵を38 °Cに設定した加湿インキュベーターに入れ、ロッキング機能をオンにします。卵のインキュベーションが完了した後、卵の頂部を70% ethanolでスプレーし、Kimwipeで素早く拭き取って滅菌します。卵殻を通じて液体が吸収されるのを防ぐため、滅菌した各卵を、ここに示しているように折りたたんだKimwipeを敷いたペトリ皿のような個別の卵ホルダーに配置します。その後、滅菌済みのAA鉗子を使用して、卵の尖った端にある卵殻の上端に小さな穴を開けます。

5 mLのシリンジに18.5ゲージの皮下注射針を取り付けます。次に、針の切端を卵の尖った側に向けて、卵殻の穴に垂直に針を挿入します。吸引によって誤って卵黄を損傷させるのを防ぐため、 l 前述と同様に穴を70% ethanolで洗浄し、スコッチテープで穴を密封します。

次に、ダブルA鉗子を用いて、水平脚のマークした上表面の、頂点から少し離れた位置に別の穴を開けます。続いて、曲がったアイリス鉗子の一方を、卵と平行になるように穴に挿入します。その後、殻を挟み込みながら、円を描くように動かします。

鶏卵の殻に直径2 cmの窓を開け、取り出した殻は廃棄します。胚は卵黄の上に不透明な円盤状に見えるはずです。卵黄表面に小さな白い点がある、または胚盤（blastoderm）が認められないなどの理由で確認された未受精卵は廃棄してください。

適切な保護メガネを着用した状態で、26.5ゲージの下気針の根元から45度の角度に曲げます。曲げた針の面（ベベル）を上に向けた状態で1 mLのシリンジに取り付け、希釈したインディアインクを針に充填します。ブラスターの外周にある卵黄膜を穿刺し、針先を卵黄の表面近くまで、胚の下側に滑り込ませます。この際、胚の層の中には入れないように注意してください。

次に、胚の輪郭をなぞるのに十分な量のインクを注入し、気泡が入らないように注意します。慎重に針を抜きます。ここで、実体顕微鏡と、ここに示す光ファイバーグースネックランプのような熱負荷の少ない光源を使用します。

Hamburger-Hamilton法に従って胚のステージを判定し、卵殻にステージを記録します。次に、脱水と汚染を防ぐため、胚の表面に温めた滅菌リンガー液を2〜3滴滴下します。

次に、パラフィルムを卵の表面に伸ばして、ウィンドウを一時的に密封します。続いて、ウズラの卵を移植の準備します。卵をインキュベーターから取り出す前に、ペトリ皿にリンガー液を満たしておきます。

次に、湾曲ピンセットを用いて卵の鈍端側を開き、胚を露出させます。解剖用ハサミを使用し、胚の外側の絨毛膜と胚盤を正方形に4箇所切断し、すべての切り口が接するようにします。その後、湾曲アイリスピンセットで切断端の一方をそっと掴み、卵から胚を取り出して、準備したペトリ皿に移します。

最後に、5番鉗子を用いて卵黄膜を慎重に取り除き、解剖顕微鏡下で胚のステージを確認します。ホストとなる鶏胚からパラフィルムを取り除きます。次に、研磨したタングステン針を用いて、神経管の目的部位の卵黄膜に小さな穴を開けます。

胚にリンガー液を1滴加えます。次に、このビデオで行っているような片側移植の場合、引火ガラス針を用いて、神経管の中脳領域に吻側および尾側の横切開を慎重に加えます。このとき、管腔内まで達しないようにしてください。その後、神経管の背側と側板中胚葉の間を両側的に切断します。

最後に、切り出したx explanを神経管から慎重に分離し、ガラスマイクロピペットで吸引して胚から取り出します。まず、ステージを合わせたウズラの胚を用意します。次に、先ほど示したのと同サイズの神経管領域を切り出し、ドナーのX explanをリンガー液が入ったガラスマイクロピペットで吸引します。

Xの外植片を、ニワトリ宿主の切除領域に隣接させて転移させます。次に、引き伸ばしたガラス針を用いて、外植片を緩やかに誘導しながら切除領域へと配置します。脱水を防ぐため、胚にリンガー液を数滴慎重に加えます。

最後に、パッキングテープで窓を密封し、窓を開けた卵の領域全体が完全に密封されていることを確認します。その後、目的のステージに達するまで卵をインキュベーターに戻します。キイラ（kyira）を培養している間はロッキング機能をオフにし、生存率を高めるために1日2回、手でゆっくりと卵を回転させてください。発生の後期ステージを対象とする場合、再培養から6時間後（HH 11）の神経管移植領域の代表的な画像では、ドナーであるウズラの移植組織がホストであるニワトリの神経管に適切に取り込まれていることがわかります。HH 11における移植領域のこの横断面図では、hnkで標識された神経堤細胞が示されており、そのうちの1つが神経管から側方へ遊走しています。

神経堤細胞の遊走流および神経管に寄与するウズラの細胞は、QCPNによって明確に標識されています。より後期の段階では、ウズラの神経堤細胞由来の細胞を最終的な標的組織まで追跡することが可能です。この図に見られるように、QCPN標識細胞は、胚齢5日（E5）のニワトリ胚の上顎突起の正中部に散在しています。QCPN抗体は他の抗体と容易に併用できるため、ウズラ由来神経堤細胞の分化を検討することができます。

宿主環境内における様子です。ここで示されているように、ウズラの神経堤細胞由来の三叉神経感覚ニューロンが、QCPNおよびT UJ one抗体によって標識されています。この手順に続き、免疫組織化学やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を用いることで、神経堤細胞がどのような組織に分化するのか、また、さまざまな組織へと分化する過程で神経堤細胞がどのような遺伝子を発現するのかといった、さらなる疑問に対する検証を行うことができます。