単一分子局在顕微鏡を用いた細胞核中の絶対DNA密度のマッピング

本法では、細胞核の絶対DNA密度測定により、翻訳後のヒストン修飾によってのみ特徴付けられるクロマチン構造の空間的制約を調査することができます。ボロノイテッセレーションとSMLMを組み合わせることで、平方マイクロメートルあたりの塩基対でDNAの絶対密度推定が可能になります。必要な唯一のアプリオリな知識は、測定された細胞核の総DNA含有量です。

今後の実験では、絶対密度差がエピジェネティック修飾の免疫蛍光やHi-Cデータなど、他の方法からの生物学的情報と相関するかどうかを調査することは興味深いでしょう。まず、事前に記録された単一の画像を並べて、スキャンされた領域を再構築します。CellProfiler を開き、パイプライン cellcycleanalysis.cpproj をロードします。

パイプラインの最初のステップの画像で、参照画像を含む画像をドラッグ アンド ドロップします。次に、参照画像が保存される場所を定義します。次に、[テストモードの開始] アイコンをクリックし、続いて [実行] をクリックします。

解析する画像内の原子核のヒストグラムが表示されたら、G1、S、およびG2フェーズの強度間隔を決定し、パイプラインの後続のフィルターオブジェクトステップに入力され、これらのステップがアクティブであることを確認します。次に、もう一度 [実行] ボタンをクリックして、パイプラインの後半を続行します。G1、S、またはG2の異なる細胞周期段階を表すオーバーレイのある3つの写真を見て、画像核の塩基対のDNAの量がわかるように、さらにイメージングするためにG1またはG2の核を選択します。

単一分子局在顕微鏡で細胞を再配置し、FPALMプロセスの適切な点滅を確認します。まず、選択した核の 3D スタックをスライスあたり 500 フレームのみを使用して記録します。これにより、中央部のDNAの相対量を決定でき、後でさらに多くのフレームで画像化され、その超微細構造が明らかになります。

50ミリ秒の露光時間を使用して画像シリーズの取得を開始すると、フレームレートは約20フレーム/秒になります。200ナノメートルのステップ間隔で、光光学セクションあたりわずか500フレームで核を通るZスタックを取ります。スタックが取得された後、初期z位置に戻り、同じ50ミリ秒の露光時間で50, 000フレームのメインデータセットを取得します。

ImageJ で FPALM データセットを開きます。点滅信号の検出設定を最適化するには、[ThunderSTORM]、[分析の実行] の順にクリックします。次に、[カメラ設定] を選択します。

画像データの正しいピクセルサイズ、A/Dカウント、使用するカメラの量子効率、ベースレベル、EMゲインを入力し、[OK]をクリックします。点滅信号をフィッティングしてローカリゼーション座標を決定するアルゴリズムを選択します。[イメージ フィルタリング] セクションで、ウェーブレット フィルター [B-スプライン] の次数が 3 で、B-スプライン スケールが 2 の [B-スプライン] を使用します。次に、分子の近似局在化方法を局所最大値に設定し、ピーク強度しきい値と接続性を8近傍に設定します。

[分子のサブピクセル局在化] セクションで、[方法] として [PSF 積分ガウス] を選択し、[フィッティング半径 px] を 3 に設定し、[フィッティング方法] を [最尤法] として選択し、[初期シグマ] を 1.6 に設定します。次に、[OK]をクリックして、信号の検出と画像の再構成を開始します。取得が異なるイメージスタックに分割されている場合は、ThunderSTORMでローカリゼーションテーブルを連結します。

これを行うには、ポップアップウィンドウで[インポート]をクリックします。[現在のテーブルに追加] オプションがアクティブになっていること、およびテーブル内のローカライズが上書きされないように正しい開始番号が使用されていることを確認します。次に、ファイルパスを選択し、[OK]をクリックして、ファイルを次々とインポートします。

連続するフレーム間で信号が過剰にカウントされないようにするには、分子あたりの最大距離 20 ナノメートル、最大オフフレーム 1、最大フレーム 0 を使用してローカリゼーションデータをマージし、[マージ] をクリックします。データサブセクションを相互相関させてドリフトを測定および補正するには、ドリフト補正メニューを開き、矢印をクリックします。ビンを 3 つ追加し、倍率を 5 に設定します。

次に、[適用]をクリックすると、xとyのドリフトを示すウィンドウが表示されます。各スライスに500フレームの事前記録された3Dスタックの各スライスのDNA含有量に比例する信号量を決定するには、プラグイン、ThunderSTORM、インポート/エクスポートの順に選択し、スタックの最初のスライスの結果テーブルをインポートします。3Dスタックの他の画像平面からの信号を過剰にカウントしないようにするには、スライス間のz単位の200ナノメートルのステップ間隔の外側からの信号を除去する必要があります。

[ヒストグラムのプロット]を押して、開いている[分布]ダイアログで[z]を選択して[OK]を押します。ピークの位置を決定し、フィルターフィールドを使用して、光学ステップサイズが200ナノメートルの信号を選択します。[視覚化] をクリックし、[ヒストグラム] オプションを選択して、[OK] をクリックします。結果の画像を TIFF 形式のフォルダーに保存します。すべてのスライスを開き、Image、Stacks、Images to Stackの順に組み合わせます。

画像領域全体を選択したら、[分析]に移動し、[ツール]をクリックして、ROIマネージャーを選択します。[追加]をクリックし、[分析]をクリックし、[測定値の設定]をクリックして、[統合密度]を選択します。次に、[その他] オプションを選択し、[マルチメジャー] を選択し、[すべてのスタックを測定] と [スライスごとに 1 行] にチェックを入れます。

[OK] をクリックすると、結果が表示されます。個々のスライスの強度がゲノム全体の割合に比例するのと同じように、すべてのスライスの強度の合計は、核全体のDNA含有量に比例します。50, 000フレームの信号を含む中心面の結果表を開いた後、100ナノメートルの厚さにフィルタリングします。

前に示したように、結果の信号のヒストグラムを作成し、中心セクションの積分密度を測定します。MATLAB スクリプト TS2orte を実行して、中央セクションの超微細構造情報を含む大きな ThunderSTORM ローカリゼーション テーブルを csv 形式から ORTE 形式に変換します。m は、ローカリゼーション テーブルを MATLAB 行列に変換し、mat 形式で保存します。

LAND-voronoiフォルダに移動し、coreAlgorithmサブフォルダでvoronoiclusterファイルを開きます。mと、絶対密度計算のために、DNA含有量、全核画分DNAの観察された中心部分の画分と局在、および使用された細胞タイプと細胞周期段階に応じて変換係数を調整します。解析voronoi.mを開始するスクリプトを編集します。

orte ローカライゼーション データへのファイル パスと結果ファイルの出力フォルダーを調整します。テッセレーションを行う領域を定義する座標を指定します。同じ入力データセット内で計算する複数の領域を定義します。

スクリプトを実行した後、絶対DNA密度を示す画像と、面積分布のヒストグラムと密度を示すグラフを含む他のファイルを探します。m ファイルに、出力フォルダー内の計算されたすべての Voronoi セルの密度が含まれています。50, 000フレームからなるFPALM測定は、厚さ100ナノメートルの中央部内で検出された局在化の6乗の2.68×10の結果となった。

再構成された画像の定位精度は10ナノメートルでした。多数の局在化により、絶対的なDNA密度を示しながら、超解像イメージングの組み合わせが可能になりました。測定されたDNA密度は核全体に均一に分布しておらず、広範なダイナミックレンジをカバーしていることは明らかでした。

核内の領域の倍率が高く、大きなボロノイ細胞はDNA密度が低いことを示し、細胞が小さいほどDNA密度が高いことを示しました。G1C3H10T半核で測定されたDNA密度は、異なるタイプと種の核内の絶対DNA密度分布を示しました。基本的な組織は初期のG1 HeLa核のように見えましたが、さらにパラセントリックヘテロクロマチンの構成クラスターを持っていました。

核サイズがわずかに大きくなったにもかかわらず、G2原子核では劇的な構造変化は観察されませんでした。TSAで処理したHeLa核は、核トポグラフィーとDNA密度に関して顕著な違いを示しました。DNA密度の高い島を示した末梢ヘテロクロマチンを除いて、クロマチンの残りの部分ははるかに均一で凝縮解除されているように見えました。