原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

このプロトコルの目的は、変形性関節症の発症と進行時の関節軟骨の機械的特性を研究するためのin vitroモデルを作成することでした。本技術の主な利点は、軟骨外植片が生成しやすく、天然の年齢軟骨を高度に代表していることである。このモデルは、さまざまな変形性関節症、診断、および治療アプローチを生体力学的レベルで分析および監視するために使用できます。

まず、メスを使って軟骨を骨から切り取ります。生検パンチを使用して、直径4ミリメートルの椎間板を生成します。ディスクを特注の切断装置に置きます。

ヘラを使用して、軟骨椎間板を固定して安定させます。軟骨椎間板をカミソリの刃で切ります。へらを使ってディスクを集め、1.5ミリリットルのチューブに入れます。

軟骨サンプルに留まるには、130マイクロリットルの細胞透過性蛍光色素を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート上のディスクをウェルごとに1枚のディスクとして分配します。96ウェルプレートを蛍光顕微鏡のプレートホルダーに置きます。適切な蛍光フィルターと対物レンズを選択します。

個々の軟骨を含む事前に選択されたウェルの下に対物レンズを配置します。椎間板に焦点を合わせて、細胞のパターンを確認します。ナビゲーター機能を選択すると、坑井全体の概要を把握できます。

マウスの左ボタンを使用してドラッグし、別のステージ位置に移動します。スキャンする対象領域を囲む正方形を選択します。ソフトウェアのフォーカスマップポイントオプションを選択し、タイルの中央を左クリックして個々のタイルを選択します。

表示されたウィンドウで、以前に選択したすべてのタイルを含むオプションフォーカスマップを選択します。タイルをダブルクリックして表示し、適切なフォーカスに移動します。次に、「Zを設定」をクリックしてフォーカル・プランを保存し、次のタイルに進みます。

個々のタイルのフォーカルプランを調整した後、スキャンの開始を押して画像取得を開始します。細胞パターンを含む事前に選択された各軟骨ディスクを、ディスクの上部、下部、左側、および右側に十分な生体適合性接着剤を追加して、ペトリ皿に固定します。L-グルタミンを含まない2.5ミリリットルのリーボビッツ培地でディスクを覆います。

ペトリ皿をAFM装置サンプルホルダーにセットします。AFMカンチレバーを校正するには、ガラスブロックカンチレバーの表面に置き、ガラスブロックの中心にある研磨された光学面に載るようにします。カンチレバーが媒体に完全に沈むまで、ステッピングモーター機能を使用して100マイクロメートル刻みでカンチレバーを下げます。

目的の軟骨測定部位を特定するには、ペトリ皿のきれいなサンプルのない領域にカンチレバーを使用してスキャナーアプローチを開始します。次に、カンチレバーをプレートの底から1.5ミリメートル引きます。明視野表示から蛍光表示に切り替えて、ディスクの上部を視覚的に識別します。

AFMサンプルホルダーをディスクの中央に向かって正確に2mm動かします。スキャナーアプローチを実行して軟骨椎間板の表面に到達し、カンチレバーを100マイクロメートル引っ込めます。力の距離曲線を生成するには、目的の測定部位に配置されたセルに焦点を合わせます。

実行ボタンをクリックして測定を開始し、各測定部位で5つの力距離曲線を取得します。検査後にカーブを保存します。ヤング率を推定するには、[分光曲線のバッチを開く]オプションを使用して、解析する生成された力の距離曲線を開きます。

ヘルツ近似モデルを選択し、続いて弾性近似オプションを選択します。次に、ヤング率を視覚化して文書化します。ポアソン比 0.5 と適切なカンチレバー先端半径を使用して調整します。

次に、力の距離曲線のフィットを視覚的にチェックして、正確性を確認します。圧痕の深さを決定するには、生成された各力距離曲線をデータ解析ソフトウェアで開き、解析プロセスとしてヘルツフィットモデルを選択します。基線オフセットの減算オプションを適用して垂直方向のたわみ軸をゼロにし、オフセットとチルト機能を選択します。

接触点検索機能を使用して、接点を自動的に識別します。垂直先端位置関数を使用して、圧痕中の生のピエゾ高さからカンチレバーのたわみのみを考慮した距離を差し引きます。elasticity-fitオプションを選択して、処理された力の距離曲線を表示します。

次に、垂直先端位置軸上で最も負の値と揃うようにグラフの領域を選択します。[XMIN] ボックスの [パラメーター] タブで、インデントを読み取って文書化します。1本の弦を含む椎間板は、中央値が2.6キロパスカルと高い剛性値を示し、これは妥協のない健康な軟骨領域を表しています。

変形性関節症の発症と進行に伴い、AFM測定では、ダブルストリングで42%、小さなクラスターで77%、そして最終的には大きなクラスターで表される進行段階で88%の剛性が段階的に大幅に低下することが示されました。拡散パターンを含むディスクは、ヤング率の単一値の重要な変動を伴う高い弾性で表示されました。主要な細胞パターン構成が割り当てられたすべての軟骨椎間板について、採用された設定値に関連するくぼみの深さは、硬さに反比例することがわかりました。

生成された力の距離曲線に見られるアーチファクトは、AFMカンチレバーと軟骨表面の接触が最適でないか、サンプルがペトリ皿に不適切に固定されていることを示しています。当社の軟骨外植片は、elizaによるタンパク質分析、免疫標識、ウェスタンモディング、PCRによる遺伝子分析など、さまざまな分子生物学的手法を用いてさらに処理および分析することができます。この方法は、関節軟骨に対する新しい治療法の直接的な影響を研究するために使用され、研究者が変形性関節症のポトーマメカニズムに関する重要な洞察を得るのに役立つ可能性があります。