原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

本実験の全体的な目的は、原子間力顕微鏡（AFM）によるマイクロインデンテーションを用いて、新鮮な鏡像肺組織の局所的な弾性特性を直接測定することにより、常在細胞に関連する空間スケールでの肺実質の局所的な機械的環境を特性評価することである。具体的には、アガロ（agarro）で膨張させたマウス肺組織をカミソリまたはメスで切断し、長さ5 mm、幅5 mm、厚さ400 µmの肺実質ストリップを作製する。次に、固定および透過処理を行っていない肺組織ストリップを免疫染色し、AFMマイクロインデンテーションを行うための関心領域を特定する。

次に、室温のPBS中にある組織片に対してFMマイクロインデンテーションを行います。新鮮な肺組織の局所的な弾性特性を直接測定することにより、結果が得られます。その結果、正常な肺実質と線維化した肺実質の組織剛性の範囲と分布には著しい差があり、特に線維化した肺サンプル内では剛性に大きな空間的変動があることが示されました。

FMマイクロインデンテーションを用いて得られた強制変位曲線から抽出した剛性マップに基づいています。組織ストリップ伸展のような既存の測定法に対する本手法の主な利点は、前例のない空間分解能を提供し、組織剛性のマイクロスケールでの変動という独自の視点を得られることです。この測定法は、組織内で剛性が空間的にどのように変動するのか、また疾患における剛性変化の範囲と空間的スケールはどのようなものであるかといった重要な疑問への回答に寄与します。

組織リモデリングをもたらすプロセス。肺組織のストリップを調製するには、まず単離したマウス肺を膨張させて切断用に肺構造を安定させます。PBSで調製した温かい2%低ゲル点アガロースを、体重1kgあたり50 millilitersの量で気管内に注入し、気管を縛った後、4°CのPBSバスで膨張した肺を60分間冷却します。アガロースが気腔内でゲル化して硬くなり、肺構造が緩やかに安定します。この間に、カミソリまたはメスを用いて、アガロースで安定させたマウス肺組織を、長さと幅が約5 by 5 millimeters、厚さが400 micrometersのストリップ状に切断します。

次に、大きな気道や血管を除外するため、ストリップを37 °CのPBSで5分間洗浄し、残留したarosを除去します。気道や大きな血管のイメージングを行わない場合は、主気管支から離れた胸膜下領域からストリップを切り出します。一方、FMマイクロインデンテーションで関心領域を分離させる場合は、主気管支により近接した肺組織からストリップを切り出してください。組織を位相差顕微鏡で観察するか、免疫染色を施して蛍光顕微鏡で観察します。

手順については、本プロトコルの記述部分を参照してください。FMキャラクタリゼーションの直前に、浮遊している組織の下からカバーガラスを持ち上げるようにして、組織片をpoly L lysineコート済みの15 millimeterカバーガラスに付着させます。この際、組織片がカバーガラスの表面に均一に広がるようにしてください。必要に応じて、組織片を2枚目の清潔な未コートカバーガラスで挟み、軽く圧力をかけて、poly L lysineコート済みカバーガラスへの組織の付着を促進させてください。

各ラウンドのマイクロインデンテーション実験の直前に、製造元の指示に従ってAFMシステムの校正を行ってください。この際、2つの重要なパラメータを決定します。空気中での熱揺らぎ法を用いたカンチレバーばね定数と、フォトダイオードの出力信号を実際のカンチレバーたわみ量に換算するために使用されるパラメータであるカンチレバーたわみ感度です。

清潔なガラススライド上のPBS中で標準的な強制変位曲線を取得し、たわみ感度を校正します。次に、強制変位曲線測定において、強制変位曲線の傾きを算出します。AFMチップをサンプルの単一箇所に向けて接近および後退させ、カンチレバーのたわみ delta D をチップ変位 delta Z の関数としてモニタリングします。ばね定数 0.06 newton's per meter のFMプローブを用い、直径 5 µm のホウケイ酸ガラス球チップを備えた窒化シリコン製トライアングルカンチレバーの使用を推奨します。

私たちは、100から50,000pascalの範囲のせん断弾性率を持つソフトマテリアルの機械的特性を評価しました。サンプルカバースリップの底面をティッシュペーパーで拭き、真空グリスを使用して標準的なガラススライドに固定します。ガラススライドをAFMサンプルステージに取り付け、ティッシュの上に室温のPBSを500microliters滴下して覆います。

次に、試料の上にAFMスキャンヘッドを配置します。接眼レンズで観察してAFMチップを視野の中心に合わせるため、顕微鏡の試料ステージを調整します。AFM試料ステージを移動させ、組織上の目的の領域を選択します。

次に、CCDカメラのビューに切り替え、必要に応じて組織の位相差画像または蛍光画像を記録します。AFMチップをゆっくりと下方へ移動させ、サンプルに正確に接触させます。軟らかいサンプルのAFMマイクロインデンテーション評価では、弾性率計算に使用されるヘルツモデルを無効にする大きな局所ひずみを避けるため、インデンテーション深さを小さくする必要があります。大きなひずみを避けるため、カンチレバーの最大たわみを500 nanometersに設定し、トリガーモードでインデンテーションを行ってください。

このたわみ制限により、最大押し込み力は 30 nano newtons 未満に抑制されます。押し込み速度は、軟組織試料の粘弾性的な性質ではなく、弾性的な性質を調べるのに十分な低速に設定する必要があります。関心領域の単一測定において、肺組織の場合は 2 to 20 micrometers per second の速度範囲を選択してください。

AFMプローブを目的の場所に移動させ、単一のインデンテーションを行い、標準的な力-変位曲線（force displacement curve）を収集します。プローブはZ方向のみに移動します。目的領域の自動マッピングを行う場合は、フォースマップモードに切り替え、選択した領域内のスキャンサイズとサンプリングポイントを選択してください。

AFMチップは、インデンテーション動作の間に試料表面を走査し、定義された試料グリッド内の各点において個別の荷重-変位曲線を収集します。80 $\mu\text{m}$ $\times$ 80 $\mu\text{m}$ の領域をマッピングする場合、インデンテーション速度 20 $\mu\text{m/s}$ で 16 $\times$ 16 の試料グリッドを使用することが実用的であり、これにより約10分で完了させることができます。ヤング率を算出するには、ここに示すように、最小二乗非線形曲線フィッティングを用いて、荷重-変位曲線をヘルツの球状インデンテーションモデルに適合させます。ここで、$F = K_C \times \Delta D$ はカンチレバーを曲げるための力です。

K sub Cはカンチレバーのばね定数です。Rは球状チップの半径であり、delta（delta Zマイナスdelta D）は押し込み深さ、newは試料のポアソン比であり、肺組織の場合は0.4となります。フィッティングの精度を評価するために、非線形曲線フィッティングにおけるデータとフィッティング値の差の二乗和であるSSR値を算出してください。

SSR値が大きい不良曲線のデータを破棄し、信頼性の低い測定値や解釈不能な測定値を排除します。必要に応じて、弾性率（E）を剛性率（G）に変換します。このとき、E = 2(1 + ν)G という関係式を用います。フォースマップモードで収集した剛性の空間パターンを可視化するには、例えば 80 µm × 80 µm の領域をカバーする 16 × 16 のグリッドで、弾性率データとコンターマップをプロットします。

大量の力曲線データを処理するために、力変位曲線を自動的にフィッティングし、弾性率を抽出したり、コンターマップまたはELAグラフをプロットしたりするためのカスタムアルゴリズムを作成することがあります。上述した手順およびパラメータを用いた場合、この図は組織が適切に切片化され、染色されていることを示しています。固定や透過処理を行わずに基底膜成分であるlamininの免疫蛍光染色で観察したところ、肺実質の肺胞微細構造が良好に保存されていました。

これらのパネルは、PBSで処置したマウス、または線維化を誘導するためにブレオマイシンで処置したマウスから採取した新鮮な未固定肺におけるコラーゲンの免疫蛍光染色を示しています。ここでは、FMマイクロインデンテーションによって得られたサンプル力変位プロットを、同一の印加力で示しています。AFMチップが軟らかい領域に大きな圧痕を作ると、青色で示される比較的平坦な力変位曲線が得られるのに対し、硬い領域では圧痕が小さくなり、赤色で示される急峻な力変位曲線が得られます。

各圧入後にクリーンなフォースカーブを得るためには、次の圧入を行う前に、AFMチップを試料表面から完全に後退させ、接触がない状態にする必要があります。この非接触状態は、カンチレバーのたわ nanoscale なしにチップが移動する、カーブの平坦な領域に対応します。この図は、チップが試料表面から完全に後退していない場合に発生する、平坦な領域のない典型的なフォースカーブを示しています。これは、軟らかい試料がチップに付着した場合などに起こり、チップが軟らかい試料に完全に埋もれている場合は、接触点を決定することが不可能になります。

曲線は明確な偏向がなく、わずかなノイズがあるように見える場合があります。この図は剛性を示しています。強制変位曲線から抽出したデータを剛性マップとして空間的に表示したもので、これをELAs graftと呼びます。色のスケールが剛性に対応しており、ELAs graftは正常な肺実質と線維化肺実質における組織剛性の範囲と分布に顕著な差があること、および特に線維化肺サンプル内において剛性に大きな空間的変動があることを示しています。

このビデオを視聴することで、原子間力顕微鏡を用いて新鮮な肺組織の局所的な弾性特性を直接測定し、肺実質の局所的な機械的環境を特性評価する方法について深く理解することができます。