形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

このプロトコルは、特定の疾患または治療による細胞形態の変化を観察するための接触モード原子間力顕微鏡の使用を示しています。この手順では、汚染を避けるために密閉容器を使用し、老化を避けるためにできるだけ早く固定サンプルを分析することを強くお勧めします。まず、サンプルが乾くまでスライドを炎の上に数回静かに通して、サンプルをスライドに固定します。

固定した試料をシャーレに入れ、原子間力顕微鏡装置に運んで観察します。次に、コンピューターと原子間力顕微鏡の電源を入れます。次に、ソフトウェアでコンタクトモード、ContAI-Gプローブ、および自動スロープオプションを選択します。

設定値を20ナノメートル、Pゲインを10, 000、Iゲインを1, 000、Dゲインをゼロ、チップ電圧をゼロミリボルトに設定して、Zコントローラーのデフォルト値を設定します。70マイクロメートルのスキャンレンジヘッドを使用して、サンプルをAFMコンタクトモードにします。スキャンヘッドに統合された2つのレンズに取り付けられたカメラを使用して、プローブの下の領域の表面をすばやく表示します。

次に、XY平面内で手動で移動して、目的の領域を選択します。接触に達するまで、プローブがサンプル表面に電子的に近づくようにします。XYの傾き方向を小さくすることで、スキャナーとサンプル表面のXY測定面を電子的に調整します。

ソフトウェアの標準パラメータを1秒あたり1行、1行あたり256ポイントに設定します。次に、70 x 70マイクロメートルの領域の完全なスキャン範囲を実行します。ズームツールを使用して小さい領域を選択します。

カンチレバーを電子的に格納し、サンプルをXY平面に沿って移動させることにより、サンプルから新しい領域を選択します。次に、前に示したように新しいスキャンを実行します。次に、フィルター選択の画像のツールメニューで行ごとのレベリングを使用して、データ処理を実行します。

カラーバーの最大高さと最小の高さを最適化して、最高の画像解像度を取得します。最後に、解析メニューを使用して画像解析を実行します。目的のツールで始点と終点を選択し、長さと距離を決定します。

細菌培養物の原子間力顕微鏡分析は、黄色ブドウ球菌培養物が球菌凝集体を有するゾーンによって分布していることを示した。スケールの増加は、人口分布と球菌の形態のより大きな評価があることを示しました。AFM接触モード画像は、1.25マイクロメートルの平均幅を示した球菌のサイズを決定することを可能にした。

シュードモナス・フナネンシスはガラス支持体表面全体に均一な分布を示し、接着性単層を形成した。培養物は長さ1.9マイクロメートル、幅0.9マイクロメートルの棒状であった。黄色ブドウ球菌の酸化マグネシウムナノ粒子のマイクロ希釈暴露は、重度の細胞構造の劣化のために滑らかな表面と均質な輪郭の損失をもたらしました。

ベシクル形成および細胞質物質放出は、MICよりも高濃度の培養物で観察された。同様の結果が大腸菌培養でも得られ、コントロールは滑らかな表面を示し、その均質な棒状形状を強調しました。この構造は、1, 000 PPMのナノ粒子曝露で完全に消失し、識別可能なシルエットのみとなった。

サンプルの固定は、さらなる分析に不可欠であるため、正しく行うことが重要です。画像フィルターは、良好な画像解像度とサンプルの詳細を提供するのに役立ちます。固定方法を使用すると、AFM非接触モードを適用でき、機械的特性の研究に役立ちます。

この方法論は、細菌の細胞損傷分析に焦点を当てた医学的および微生物学研究のための安価で有用なツールになる可能性があります。