原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する
2013年6月27日
本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。
次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して生細胞の弾性率を測定することです。これは、最初にセル上のさまざまな場所でFM力分光測定を実行することによって達成されます。2番目のステップとして、すべての強制距離曲線が解析され、A FMチップが最初にセルに接触するポイントが決定されます。
次に、接触点から始めて、最初の200〜300ナノメートルのインデンテーションデータをヘルツモデルに適合させます。弾性率を抽出するために、結果は、各ピクセルが単一の強制距離曲線を表すフォースマッピングモードを使用して得られたセル剛性の2Dマップを生成します。この手順を開始するには、カンチレバーホルダーを70%エタノールで洗浄し、乾かします。
次に、メーカーの指示に従って、bru DNP 10カンチレバーをAFMにロードします。次に、逆光学レバー感度を校正します。このパラメータは、フォトダイオードの応答量をカンチレバーのたわみのナノメートルあたりのボルト数で表します。
これを達成するには、まずきれいなスライドガラスをサンプルステージにロードします。a FMヘッドを取り付け、製造元の指示に従ってレーザービームと位置合わせを調整します。位置合わせが完了したら、P eight Oを引き抜いた状態で、スライドガラスにAFMチップをかみ合わせます。
ミラーをマイナス2ボルトのフォトダイオードの読み取り値に再調整します。次に、最大フォトダイオード応答または正2ボルトのトリガーポイントで力分光測定を実行します。データ取得が完了したら、力曲線の固い接触領域にズームインし、この領域に線形フィットを実行します。
傾きをボルト/ナノメートルで求めるには、ミラーの位置合わせを0ボルトの自由たわみにリセットします。次に、levy と Malam によって記述された熱調整法を使用して、カンチレバーのばね定数を較正します。まず、スキャナーをサンプルステージから離して、チップとサンプルの間に相互作用がないようにします。
次に、カンチレバービームの熱振動を記録して熱データを取得します。A FMソフトウェアは、このような熱振動のパワースペクトルを解析し、データウィンドウにプロットします。次に、最低周波数 (基本共振ピークとも呼ばれる) を中心とするデータ セグメントに近似を実行して、ばね定数を決定します。
カルチャープレート用のFMを準備するには、FMステージにディッシュヒーターアクセサリーを取り付け、温度を摂氏37度に設定します。システムが安定した熱平衡に達するまで20分待ちます。予熱したら、FMステージに培養皿を置き、30分以上の測定のために皿ヒーターに付属のクランプを使用して固定し、二酸化炭素に依存しない培地を使用して通常の培地を置き換える必要があります。
次に、A FMカンチレバーの先端に37°Cの培地を少量滴下し、先端がちょうど液体に沈むまでA FMヘッドを下げます。上面図のCCDカメラを使用して、カンチレバーのレーザービームを再調整します。液体中の整列は、媒体の屈折率の変化により、空気とは異なります。
位置合わせが完了したら、培養皿の無細胞領域にA FMチップをかみ合わせ、液体環境で逆光学レバー感度のキャリブレーションを行います。細胞の機械的特性測定を開始するには、光学顕微鏡を使用して、カンチレバーの先端を細胞のperle眼領域の上に配置します。カンチレバーの位置の正確な調整は、XスキャナーとYスキャナーにオフセットを適用することで実現されます。
次に、a FMを4つの分光モードに切り替え、インデント率を毎秒5マイクロメートルに設定します。これは、流体力学的影響を回避するのに十分な低さです。次に、たわみトリガーポイントを2ナノニュートンに設定します。細胞の損傷を避けるために、サンプルの剛性に応じてこの値を調整します。
さらに、相対トリガオプションを選択すると、偏向信号のドリフトが補正されます。次に、力の距離を5マイクロメートルに設定して、力の測定の間に先端がセルから完全に離れるようにします。各条件について、少なくとも30個の細胞の核領域の異なる位置に3つの力曲線を収集します。
ただし、各セルで複数の曲線を取ることは有益です。信頼性の高い統計データを得るためには、取得しすぎると、A FMプローブによる苦痛により細胞の硬さが変化する可能性があります。フォースマップモードを使用して、単一セル全体の機械的特性の分布をさらに特徴付けます。
フォースマップモードでは、スキャンサイズを30マイクロメートルに、解像度を32 x 32に設定し、インデントパラメータは単一のフォースカーブで選択したものと同じです。次に、A FMは、サンプル領域の各ピクセルで単一のフォースカーブを取得し、領域全体の剛性マップを提供します。次に、記録された力曲線を MATLAB を使用して解析し、セルの剛性を計算します。
まず、Lynette Alが最初に発表したアルゴリズムを採用し、matlabを使用して各点から線形近似とヘルツ近似の両方を計算します。両方の近似の相対 RMS 誤差を計算し、各点でこれらの値を合計します。最小の合計フィッティング誤差を達成する点は、この点を特定する最初の接触点として選択されます 細胞のヤング率の正確な測定にとって重要です。
次に、サンプルの変形デルタを計算します。次の式をセル接触前の変形でゼロに等しく、Z は Z より小さく、カンチレバーの変形 D と接触点を過ぎた合計距離 Z との差に等しくなります。次に、セル接触前の力がゼロに等しい場合、ZがZより小さく、カンチレバーのばね定数Kに接触点を過ぎたカンチレバーのたわみを掛けたものに等しい場合、次の式を使用してインデント力Fを計算します。
次に、Elise squareのフィットをヘルツモデルの接触後領域のサンプル変形とインデント力のデータに適用し、示されている先端の形状に基づいてセルのヤング率を抽出します。これは、3つの異なる表面で培養された3つのT、3つのファイバーブラスト細胞から得られた代表的な力曲線です。ここでわかるように、表面の違いが細胞骨格の硬さに大きく影響します。
硬質プラスチック表面で培養した細胞の平均変形を赤色で示しています。硬いポリアクリルアミドゲルで成長したものは紫色で、弾性のあるポリアクリルアミドゲルで成長したものは青色で示されています。曲線の接触点を慎重に特定すると、細胞変形の関数としてのインデント力を正確に示すことができます。
さらに、彼らのヤングのモジュラーは、接触後の最初の300ナノメートルのくぼみから正確に計算することができます。ここに示されているのは、中間フィラメントの一種である緑色蛍光タンパク質タグ付きメントンをトランスフェクションした線維芽細胞です。画像が明るいほど、その領域にはマントンが多く含まれています。
これは、細胞細胞骨格の硬さに関連している可能性があります。ここで紹介するA FMフォースマッピング技術を使用すると、各ピクセルが2.5 x 2.5ミクロンのセル表面積を表す32 x 32ピクセルの解像度でファイバーブラストの同様の剛性マップを示すことができます。このビデオを見た後、原子間力顕微鏡を使用して生体組織細胞の弾力性を測定する方法についての良いアイデアが得られます。
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概要
本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いたマイクロインデンテーションにより、生細胞の機械的特性を評価するプロトコルを提示します。本研究では、フォーススペクトロスコピーとデータ解析を通じて、生細胞の弾性率を測定することに焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞力学
- 生物物理学
- 原子間力顕微鏡
背景
- 細胞の機械的特性を理解することは、さまざまな生物学的応用に不可欠です。
- 原子間力顕微鏡（AFM）を用いることで、細胞の剛性を高解像度で測定することが可能です。
- 弾性係数は、細胞の機械的特性を評価するための重要なパラメータです。
- フォースマッピングにより、細胞剛性の空間的な変動に関する詳細な知見を得ることができます。
研究目的
- AFMを用いて生細胞の弾性率を測定すること。
- 細胞の力学的特性を評価するためのプロトコルを開発すること。
- フォースマッピングデータに基づき、細胞剛性の2Dマップを作成すること。
使用方法
- 細胞上のさまざまな位置におけるFM力分光測定。
- 接触点を決定するための力距離曲線の解析。
- 弾性率を抽出するための、Hertzモデルへの押し込みデータのフィッティング。
- 細胞の2次元剛性マップを作成するためのフォースマッピングモード。
主な結果
- 生細胞の弾性率の測定に成功。
- 細胞硬度の変動を示す詳細な2Dマップの作成。
- 大学院生によるプロトコルの実演。
- 細胞の機械的特性を評価するための信頼性の高い手法の確立。
結論
- このプロトコルは、細胞力学を研究する研究者にとって有用なツールとなります。
- AFMを用いた測定により、細胞の挙動への理解を深めることができます。
- 今後の応用として、疾患状態や細胞応答の研究などが考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
原子間力顕微鏡（AFM）を用いた細胞の機械的特性の定量的測定により、バイオ医薬品開発チームは微小環境の変化に対する細胞応答を評価でき、初期探索およびターゲット検証を支援することが可能になります。信頼性の高い剛性マッピングは、疾患関連システムにおけるメカニズム的なリスク低減と予測の信頼性に寄与し、ポートフォリオの選別やトランスレーショナルリサーチに直接的な影響を与えます。AFMベースの弾性率測定を統合することで、創薬パイプラインの重要な局面における意思決定が強化されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 生理的または病理的状態の機能的バイオマーカーとして、細胞剛性の直接的な定量化を可能にします。
- 細胞骨格の変化を疾患モデルや化合物の影響と相関させることにより、メカニズム面でのリスク低減をサポートします。
- 基質や遺伝的摂動に対する細胞応答に関する仮説検証を促進します。
- 細胞ベースのアッセイにおけるターゲットバリデーションのための定量的なエンドポイントを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの標準化に向けた、再現性のある定量的な力曲線および剛性マップを提供します。
- 複数の細胞条件下における機械的表現型のハイコンテンツスクリーニングを可能にします。
- 細胞力学を標的とした化合物評価のための、堅牢でスケーラブルなアッセイの開発をサポートします。
- フォースマッピングと自動データ解析ワークフローを統合することで、アッセイの準備状態を向上させます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 機械的特性の測定を疾患関連の表現型と整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を可能にする。
- 細胞力学と機能的アウトカムを関連付けることで、探索から前臨床検証までの連続性を提供する。
- 定量的で生理学的に妥当なデータに基づき、リスクを調整した進展判断を可能にする。
- 機械的な不均一性をマッピングすることで、前臨床モデルにおける予測的なリスク低減を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
AFMを用いた細胞剛性測定は、初期の探索から前臨床までの連続的なプロセスに適合し、メカニズム研究とトランスレーショナルリサーチを橋渡しする役割を果たします。
- 探索生物学： 定量的な力マッピングにより、細胞応答が明確になり、生物学的仮説のリスクが軽減されます。
- スクリーニング： 標準化されたフォーススペクトロスコピーの出力により、条件間および化合物間での再現性のある比較が可能になります。
- 分析： MATLABベースの分析により、定量的ヤング率および空間的な剛性マップが得られ、堅牢なデータ解釈が可能になります。
- トランスレーショナルリサーチ： 機械的フェノタイピングが疾患モデルと整合し、バイオマーカーの連続性をサポートします。
- 企業内での再利用： AFMプロトコルおよび分析ルーチンは、さまざまな細胞型や実験システムに適応可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞ベースモデルにおける予測精度を向上させ、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：機械的特性の測定を標準化し、チーム間の再現性を向上させる。
- 戦略的価値：堅牢な定量的エンドポイントを提供することで、ゴー/ノーゴーの意思決定に寄与し、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：機能的な細胞表現型に基づいた、リスク調整後の優先順位付けおよび創薬プログラムの推進を可能にする。
実施上の考慮事項
- AFMの操作、フォーススペクトロスコピー、および定量的なデータ解析の専門知識が必要です。
- 校正済みのAFM装置および互換性のある解析ソフトウェア（例：MATLABルーチン）へのアクセスが不可欠です。
- 校正、測定、および解析プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 押し込みパラメータを慎重に調整することで、さまざまな細胞種や基質に適応させることが可能です。
- 潜在的な制限として、プローブによる細胞へのストレスや、接触点の慎重な特定が必要なことが挙げられます。
