使い捨て診断用マイクロ流体アプリケーション

私はキャサリン・クラウドブリッジです。ボストン大学の製造、工学、および生物医学工学の教授であり、生物医学マイクロデバイスおよびマイクロ環境研究室のディレクターを務めています。私たちは主に、資源が限られた環境での応用のための使い捨て診断装置の開発に取り組んでいます。

そのため、これらのデバイスを製作するためにマイクロフルイディクスを利用しています。私たちは、実際には2つの研究分野に関心を持っています。主に、バイオ分子や細胞がプラスチックポリマー表面とどのように相互作用するかに注目しています。

それが私たちの主要な研究領域です。その成果は、使い捨て診断向けのマイクロ流体アプリケーションに具体化されています。したがって、研究室ではマイクロ流体デバイスを製作しています。

熱可塑性材料を用いる場合、一般的に使用されるPDMS（多くの研究者がラボでマイクロ流路作製に使用するゴム状の材料）は使用しません。私たちは熱可塑性プラスチックでデバイスを作製しています。これらの熱可塑性デバイスを用いて、中央集中型のラボから離れた現場（フィールド）でも分子生物学的な解析が行えるよう、マイクロスケールでの分子生物学の実装を目指しています。

研究室における具体的な実装としては、小型のプラスチックカードを製作し、その内部に固相抽出カラムや細胞溶解カラム、あるいは混合カラムを組み込んでいます。また、検出手法として、チップ上でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）も行っています。これらすべてを小型デバイスに統合しており、研究の長期的な展望としては、最終的にハンドヘルド型の統合デバイスを実現させることで、遠心分離機や加熱インキュベーターなどの設備が整った大規模な研究所が利用できないフィールドや環境においても持ち運び、使用できるようにすることを目指しています。

理想的には、血液、尿、便、あるいは鼻咽頭スワブ（粘液）などのヒト検体から開始し、チップの出力として、特定の微生物への感染があるかどうかの「はい」か「いいえ」という答えを得たいと考えています。その方法は、患者の検体中にある、その微生物特有のDNAまたは（微生物の種類に応じて）RNAを検出することによって実現します。

したがって、技術的な課題は主にサンプル調製の段階にあります。血液や糞便、尿などの検体から開始する場合、多くの粒子状物質やPCRおよびその他の増幅技術の阻害物質が含まれている複雑なヒト検体から、最終的に非常にクリーンな核酸溶出サンプルを得る必要があります。これにより、特定のDNAまたはRNAを増幅または探索し、目的の微生物が存在していたかどうかを判断することが可能になります。

これらのサンプルを精製するために、いくつか行う必要があります。まず、サンプルのろ過を行う必要がありますが、サンプルによっては、チップに導入する前に粗ろ過や短時間の遠心分離ステップが含まれる場合があります。したがって、私たちは常に、臨床医から提供された状態のサンプルから開始するようにしています。

尿、便、および鼻咽頭スワブについて、私たちの目標は、臨床医に通常通りに処置を行い、通常通りに検体を採取してもらうことです。その後、その検体をチップに導入します。したがって、その段階でさらなるろ過が必要な場合は、チップ内でろ過が行われることになります。

分子アッセイを行うため、第2ステップでは、サンプル中の細胞および微生物を溶解させる必要があります。そこで溶解ステップを行い、通常は小孔径のフィルターにサンプルを強制的に通過させます。場合によっては、このフィルターにカーボンナノチューブのようなナノ粒子が含まれており、その鋭いエッジを利用して、我々が扱っているグラム陽性菌であり溶解が非常に困難な C difficile のように、より強固な細胞壁を持つ生物を破砕することができます。

そのため、より堅牢なライシスカラムを用意する必要があります。通常は、チップ内で化学的および機械的なライシスを組み合わせて行います。その後、ライセートから精製された核酸を抽出することを目的としています。

そこで、溶解物をマイクロ流体チップ内に組み込まれた固相抽出カラムに通します。この固相抽出カラムはプラスチック製で、チップの作製後にマイクロ流体チャネル内で光開始化学を用いて作製されています。また、核酸を結合および放出させるため、通常はシリカ粒子が含浸されています。

場合によっては、例えばmRNAを特異的に結合して遊離させたい場合にはoligo DTビーズを、あるいは特定のタンパク質を結合して遊離させたい場合には特定の抗体を結合させたビーズを組み込んでいます。そして、これらの機能をすべて備えた抽出カラムを作製することも可能です。しかし、本日はシリカビーズを用いたベース抽出カラムの作製方法について説明します。

その後、溶解液をシリカカラムに通します。これは、マクロスケールの研究室で使用されるQiagenキットと同様の仕組みで動作します。次に、細胞溶解液やヒト試料の残りの部分に含まれる、不要な炭水化物や脂質などの不純物をすべて除去するために洗浄を行います。そして最後に、水で溶出させます。

これらのマイクロスケール固相抽出カラムの利点は、通常1〜5 µLというごく少量の水で溶出できることです。これにより、投入した核酸のほぼすべてを回収することができ、そのチャネルから回収される最初の10 µLで約70〜90%の回収率が得られます。

したがって、2〜10 µLで2回洗浄を行うことで、投入した核酸のほぼすべてを回収できます。これにより、PCR可能なクリーンなサンプルが得られるだけでなく、標準的なベンチトップキットで得られるよりもはるかに高濃度のサンプルが得られます。つまり、これらすべてのサンプル調製技術の最終的な目的は、他者が行ってきた他の研究内容と互換性のあるサンプルを作成することにあります。

チップ上でのPCR増幅が可能であることを示した、非常に優れた研究成果です。RNAウイルスを扱う場合や、遺伝子発現実験を行いたい場合は、チップ上で逆転写反応を行うことができます。当社のサンプル調製技術はチップ上のPCRと直接的に結合させることができるため、ベンチでの精製やサンプル調製を行う必要はありません。

また、小型チップ上でマルチプレックスPCRを行うために必要な極微量を確保するための、濃縮工程についても必要になります。そこで本日ご紹介する実験では、PDMSではなく熱可塑性プラスチックで作られたマイクロ流体チップの組み立て方法、すなわち、一般的な手法とは少々異なる作製プロセスと、チップの密封方法について解説します。

次に、チップ内部で光開始化学反応を行い、細胞溶解と固相抽出の両方に用いられるポリマーモノリスを作製する方法について説明します。現在、研究室ではこれらの工程をモジュール形式で進めていますが、これらは統合可能であり、実際に統合もされています。このプロセスの最終的に、水中に高濃度で濃縮された核酸（RNAおよびDNA）のサンプルが得られ、それをPCRモジュールや他の増幅モジュールに送ることで、微生物や感染症の特定が可能になります。現在、私たちは一つの助成金プロジェクトに取り組んでおり、ボストン医療センターから、インフルエンザA型に感染している可能性のある患者のヒトサンプルを収集し始めています。現在はインフルエンザの流行シーズンであるため、これらのサンプルを収集しています。

そして研究室では、誰がインフルエンザA型に感染しているかを確認するためのゴールドスタンダードな分析を行っています。これは基本的に培養法であり、実施に数日かかります。それと並行して、これらのサンプルを現在開発中のチップの各モジュールに通しています。具体的には、溶出カラムに通し、固相抽出カラムに通した後、PCRを行い、ゴールドスタンダードな手法と比較してどの程度の精度が得られるかを確認します。

それが現在の状況です。これらの実験がうまくいけば、今後4年から6年ほどで、インフルエンザA型向けの集積チップと完全なアッセイが完成する状況になると考えています。また、現在はクロストリジウム・ディフィシル（clostridium difficile）および便検体についても取り組んでいます。さらに、デバイスの統合だけでなく、アッセイの統合もほぼ完了しつつあります。

したがって、アッセイの開発とチップの設計は密接に連携して行う必要があります。特定のアプリケーションを臨床現場へ導入する場合、それはまさにターゲット指向のプロセスとなります。臨床現場での使用に向けてチップを最適化するためには、開始時のサンプルと、検出対象となる微生物について把握していなければなりません。

したがって、プロトタイプ形式でそれを実現させるまで、それほど時間はかからないと考えています。それらが私たちの最終目標ですので、到達できることを願っています。