Penium margaritaceumの実験的スクリーニングプロトコル、免疫細胞化学および顕微鏡ベースのイメージング技術

私たちの研究は、細胞の形状を維持し、外部ストレスに反応する細胞壁の役割に焦点を当てています。私たちは、生細胞の細胞壁構造をイメージングするためにさまざまな光学顕微鏡および共焦点レーザー走査顕微鏡技術を使用し、細胞壁の高解像度イメージングのために電子顕微鏡を使用しています。

細胞壁の動態を強調するために特定の細胞内タンパク質を発現する連鎖球藻類の形質転換細胞株が現在不足しています。これには、抗体やその他の蛍光プローブを使用して研究する必要があります。ペニウムの細胞壁は、さまざまな形態の非生物的および生物的ストレスに反応し、これが表現型の可塑性につながります。細胞壁ペクチンがこのプロセスの重要な部分であることがわかりました。単細胞表現型とペニウムによる生細胞標識を実行する能力は、植物生物学者に細胞壁の構造と発達を掘り下げる機会を提供します。

[講師]まず、5ミリリットルの活発に成長している液体細胞培養物を除去します ペニウムマルガリタセウム。15ミリリットルのプラスチック遠心分離管に移し、次に遠心分離します。上清を注いだ後、ペレットを5ミリリットルの新鮮なWHMに再懸濁します。チューブキャップをしっかりと固定し、チューブを10秒間激しく振ってペレットを再懸濁させ、細胞壁表面から細胞外高分子物質を除去します。最終洗浄後、ペレットを1ミリリットルの新鮮なWHMに再停留させ、次に200マイクロリットルの細胞懸濁液のアリコートを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。キャップチューブを微量遠心分離機で1000 Gで1分間遠心分離し、次に上清を吸引し、ペレットを400マイクロリットルの新鮮なWHMに再懸濁します。次に、20マイクロリットルの希釈モノクローナル抗体を細胞懸濁液に加え、ウェルテックスします。次に、チューブをアルミホイルで包み、実験室の回転子で90分間インキュベートします。懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なWHMに再懸濁してから10秒間ボルテックスします。最終遠心分離後、ペレットを400マイクロリットルのWHMに再懸濁し、8マイクロリットルのヤギ抗ラットTRITCまたはFITCを加えます。最後に、ペレットを100マイクロリットルの増殖培地に再懸濁します。チューブにキャップをかぶせ、イメージングの準備が整うまでアルミホイルで包みます。JIM5抗体で標識した細胞をWHMで10倍に希釈します。希釈した細胞懸濁液を50マイクロリットル滴下して、カバースリップに加えます。細胞を暗所で2分間インキュベートして細胞の付着性を確保し、次に1ミリリットルのWHMを滴下して慎重にピペットで滴下して、接着していない細胞を洗い流します。取り付けられたセルの上に30マイクロリットルのWHMを追加します。液滴に30マイクロリットルの温かい4%アガロースをWHMで重ね、固めます。ペトリ皿内のサンプルの場合は、アガロース包埋細胞を完全に覆うのに十分なWHMを追加します。カバースリップ上の細胞の場合は、カバースリップを反転させ、WHMで満たされたくぼみスライドの上にそっと置きます。調製した細胞を蛍光顕微鏡に取り付けます。外部ランプをセットアップするか、顕微鏡の内蔵照明を使用して、細胞の成長と動きをサポートします。細胞壁の増殖を追跡するTRITCフィルターセットを使用して、10〜30分ごとに画像をキャプチャします。5ミリリットルの洗浄された10〜14日齢の細胞培養物を含むチューブを準備します。次に、約100マイクロリットルの0.75マイクロメートルの蛍光ビーズを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。1ミリリットルのWHMをチューブにピペットで入れ、激しく振ってビーズを再懸濁させます。チューブを10,000 Gで3分間遠心分離します。最終ペレットを500マイクロリットルのWHMに再懸濁します。次に、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのWHM培地をピペットで移管します。阻害剤または成長調整剤を加えて所望の濃度にし、プレートを穏やかに回転させます。10マイクロリットルのビーズ溶液を加え、もう一度穏やかに旋回して混合し、次に10マイクロリットルの洗浄細胞を各ウェルに加えてから混合します。プレートを光の下で24時間インキュベートします。プレートを乱すことなく、FITCフィルターを備えた倒立蛍光顕微鏡に置きます。1ミリリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで取り出します。チューブを4,000 Gで1分間遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットの入ったチューブを液体窒素に浸すか、摂氏マイナス80度で凍結します。解凍したペレットを20マイクロリットルのWHMに再懸濁します。高密度の細胞懸濁液を45 x 50ミリメートルのカバースリップに一滴置きます。ドロップの上に2番目のカバースリップを置き、サンドイッチを作ります。サンドイッチを30秒間押し続けて細胞を破裂させます。カバースリップを慎重に分離します。カバースリップの上にWHMを加えて、破裂した細胞を15ミリリットルの遠心分離管に洗浄し、遠心分離します。上清を廃棄した後、白またはわずかに緑色のペレットを調べます。 細胞壁を含むペレットを脱イオン水に再懸濁します。細胞を破裂させて遠心分離した後、ペレットを100マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁してから、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、ケンブリッジのスタブの表面にカーボンテープを貼り付けます。再懸濁した細胞壁懸濁液を5マイクロリットル滴をカーボンテープにピペットでかけます。パラジウムターゲットを使用して、スタブを一晩乾燥させた後、50秒間スパッタコートします。二次電子検出器から10センチメートルの適切なスポットサイズを配置して、5キロボルトでセルを観察します。P.マルガリタセウムの細胞壁を抗ペクチンモノクローナル抗体で標識すると、不規則な格子パターンを形成するカルシウム錯体線維のネットワークが明らかになりました。ペクチンは細胞中心または峡部に沈着し、古いペクチンを極に向かって押し出しました。JIM7標識は、高メチルエステル化ペクチンが最初に峡部の狭い帯域で分泌されることを示しました。アラビノガラクタンタンパク質などの細胞壁内の他のポリマーは、モノクローナル抗体JIM13で検出されました。細胞壁の外側に大量の細胞外高分子物質が分泌され、グライディングや細胞凝集が可能になりました。標識技術により、発生イメージングアプローチを統合して、定量的な細胞壁と増殖研究が可能になりました。相関構造研究により、典型的なペクチン格子は、異なる突起で外部に終端する繊維のメッシュで構成されていることが明らかになりました。高濃度のカルシウムによる処理により、JIM5標識細胞で観察されたように、ペクチン格子が不規則な沈着物に変換されました。カルシウム処理した細胞壁を走査型電子顕微鏡で調べたところ、無秩序なペクチン構造が詳細に観察されました。