微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

微小管は、細胞分裂と細胞内輸送に重要な役割を果たす細胞骨格ポリマーです。本研究では、マイクロ流体工学を採用して微小管の力学をin vitroで研究します。この研究は、マイクロ流体デバイス内の微小管を研究するための2つの特定の制限、つまりタンパク質を変性させる可能性のある気泡の可能性と、ハイスループットアッセイの使用の欠如に対処しています。当社のマイクロ流体デバイスとプロトコルにより、以前のフローセルアッセイよりも堅牢なハイスループット試験機能を備えたさまざまな実験セットアップが可能になります。

[講師]まず、酸素またはクリーンな乾燥空気プラズマを使用して、真空下で3インチシリコンウェーハを5分間プラズマ洗浄します。真空圧がマイナス5torrの10乗の5倍未満であることを確認してください。クリーンなシリコンウェーハをフォトレジスト蒸着用のスピンコーダーに中央に配置し、1〜2ミリリットルのSPR 227.0フォトレジストをシリコンウェーハの中心に堆積させます。フォトレジストをスピンコートして、毎分1000回転で30秒間、厚さ13マイクロメートルの層を実現します。コーティング面との接触を最小限に抑えながら、シリコンウェーハを70°Cに設定したホットプレートに移します。シリコンウェーハをホットプレート上でインキュベートし、温度が摂氏115度に達するまで、3〜5分ごとに温度を10°C上げます。次に、ホットプレートの電源を切り、温度が摂氏 65 度を下回るまでシリコン ウェーハを冷却します。鉗子を使用して、冷却されたウェーハをマスクアライナーに移します。メーカーまたはサイト固有のプロトコルに従って、シリコンウェーハと適切なフォトマスクの両方をアライナーにロードし、ウェーハを約400ミリジュール/平方センチメートルのエネルギーで紫外線にさらします。式を使用して必要な露光時間を計算します。再水和と熱処理の後、ウェーハを適切な現像液に浸します。次に、ウェーハの両面を脱イオン水で30秒間優しくすすいでください。開発したウエハーを窒素ガスで乾燥させた後、デシケーターに移します。小さなアルミ容器をデシケーターに入れ、アルミ容器にシランを1滴加えます。乾燥後、混合および脱気したポリジメチルシロキサンをペトリ皿内のマスターモールドに注ぎます。PDMSが完全に硬化するように、ディッシュを摂氏65度で一晩インキュベートします。デバイスの特徴の周囲で、メスまたはカミソリの刃を使用して、マスターレイヤーからPDMSの長方形の断片を切り取ります。各部品に適切な接着接触を可能にする適切な側面スペースがあり、22 x 22 ミリメートルのガラス カバー スリップに適合することを確認してください。PDMSを予備の犠牲PDMS層に置き、硬い表面を避けます。次に、きれいな1.5ミリメートルの穴あけパンチを使用して、各PDMSピースに入口と出口の穴を開けます。次に、22 x 22 ミリメートルのガラス カバー スリップを取り出し、イソプロピル アルコールを混ぜたワイプを使用して掃除します。次に、清潔で乾燥した空気プラズマを使用して、真空下でガラスカバースリップを5分間プラズマ洗浄します。ガラスカバースリップとPDMSの特徴面の両方をイソプロピルアルコール結合ワイプで拭いてから、両方をプラズマクリーナーに入れ、同時にクリーンで乾燥した空気プラズマを使用して真空下で30秒間プラズマ洗浄します。クリーニング後、PDMSを反転させて、フィーチャー面が下を向くようにします。PDMSをガラスカバースリップの上に置き、軽く押して接着を促進します。安定化された微小管延長部は、緩衝液を成長方向に垂直に流すことによって曲げられ、デバイス内に方向力を加える能力が実証されました。微小管が経験する表面近傍の流速は、ナビエ・ストークス方程式に基づくシミュレーションと解析モデリングを使用して、毎秒 92 マイクロメートルとして計算されました。計算シミュレーションでは、予測可能な濃度パターンを示す蛍光色素によって実験的に確認されたデバイス全体の安定した勾配の確立が実証されました。二重標識微小管の伸長により、デバイスに沿った異なる空間ゾーンで異なる蛍光タンパク質が優勢な勾配ベースの分配が確認されました。