レーザー誘起位置イオン化質量分析によるラット神経細胞の蛍光ガイド下マトリックス支援レーザー脱離イオン化

私たちの研究は、細胞の不均一性を明らかにし、分子プロファイルを複雑なシステムにおける細胞の同一性、機能、および応答に関連付けるための、ハイスループット、画像誘導、シングルセルMALDI質量分析ワークフローの開発に焦点を当てています。

MALDI-2や高空間分解能質量分析計などの高度な機器により、単一細胞の標的を絞った空間分解能分析が可能になり、感度が向上し、複雑な組織における分子プロファイリングの範囲が拡大します。現在の課題には、感度の制限、サンプル間の再現性、複雑なデータ分析などがあります。MALDIデータは、多くの場合、数千の細胞と数百の分子を含むまばらで大規模なデータセットであるため、堅牢な計算ツールが必要です。

このプロトコルは、個々の細胞や細胞小器官を分析するためのハイスループット法のギャップに対処し、不均一性の非常に詳細な研究を可能にし、分子および細胞の生物学と機能についての洞察を得ることができます。

このプロトコルにより、スライド全体に散在する細胞の迅速な標的分析が可能になり、細胞操作や全領域スキャンが不要になり、スループットが大幅に向上します。

[ナレーター]まず、各スライドを2〜3ミリリットルの150ミリモル酢酸アンモニウムですすぎ、顕微鏡検査やMALDIマトリックスの塗布を妨げる可能性のあるグリセロールと塩の結晶を除去し、穏やかな窒素流でスライドを乾燥させるか、完全に自然乾燥させます。乾燥したスライドを顕微鏡ステージにロードします。スライド全体に均等に分布した少なくとも10個のサポートポイントを使用して、顕微鏡の焦点を合わせます。DAPIおよび明視野イメージングに適したフィルターを使用して、スライド全体のタイル状蛍光画像を5倍から10倍の倍率で取得し、顕微鏡スライド上の基準マーカーが画像に明確にキャプチャされるようにします。ZEN ZEISSなどの顕微鏡ソフトウェアを使用して、タイル化された画像をステッチします。垂直に隣接するタイルがオフセットされていないことを確認します。ステッチされた各画像を、顕微鏡ソフトウェアを使用してBigTIFFファイルとして、または最終的な画像サイズが2ギガバイト未満の場合は標準TIFFとして処理してエクスポートします。20ミリグラムの2,5-ジヒドロキシアセトフェノンを1.5ミリリットルのアセトンに溶かします。スライドを昇華チャンバーのホルダーに入れ、次にホルダーを昇華装置に入れます。溶解したマトリックス溶液をセラミックウェーハにピペットで置き、アセトンを完全に蒸発させてから、昇華チャンバーを閉じて密閉します。クーラントチャンバーに氷水スラッシュを入れ、昇華チャンバーの上にしっかりと置きます。真空ポンプの電源を入れ、システムを5分間平衡化させます。チャンバーを摂氏200度に5分間加熱して昇華を開始します。5分後、チャンバーから氷水浴を取り出します。温度を摂氏25度に回し、チャンバーの上にヒートシンクを置きます。昇華チャンバーをゆっくりと通気して圧力を解放します。チャンバーを開き、スライドを慎重に取り外します。MicroMSを開き、明視野チャネルと蛍光チャネルの両方に対応する画像グループオプションを使用してBigTIFF顕微鏡画像をデシメートします。[BLOB オプション] ツールに移動し、BLOB の最大サイズと最小サイズを調整して、許容可能な BLOB サイズの範囲を定義します。ブロブ検出の蛍光チャネルのしきい値を設定します。円度の値を指定して、識別されたセルが考慮されるために必要な円形を定義し、色を選択します。[BLOB 検索] オプションを使用して、BLOB を検出します。プロンプトが表示されたら、BLOB リストを目的の名前で保存します。[距離フィルター] ツールを使用して、各セル間の最小距離を設定します。テストポイントを介して誤差をテストし、オフセット誤差を正確に決定します。MTP スライドアダプター II を使用してスライドを装置にロードします。MicroMSでコンピューターに戻った後、リモートデスクトップアプリケーションを介して質量分析計コンピューターにアクセスします。計測器を初めて使用する場合は、「ツール」に移動し、続いて「計測器設定」に移動して、その位置を確認します。ポップアップウィンドウで、座標のセットをX位置とY位置で表示し、スライドアダプタIIジオメトリ上のこれらの特定の点をそれぞれ選択します。MicroMSウィンドウのX位置とY位置を更新します。質量分析計のカメラとステージコントロールを使用して、スライド上の簡単に識別できる場所に移動し、機器座標をコピーします。MicroMSでは、顕微鏡画像内の同じ位置を見つけて右クリックし、ポップアップウィンドウに座標を入力します。座標を最も近い整数に丸め、スペースで区切ります。3 つの登録ポイントが追加されると、円の 1 つが赤に変わり、登録から最もずれている位置であることを示します。Control + 右クリックを使用して登録ポイントを削除し、もう一度やり直してください。[ファイル] で、[保存] に移動し、[登録] に移動して登録ファイルを保存します。スライドにブロブが表示された状態で、[ファイル]、[保存]、[計測器位置]の順に進み、計測器位置ファイルを保存し、リモートデスクトップソフトウェアを使用して、このファイルを計測器コンピューターに転送します。 カスタム XEO ファイルを開き、その内容を MTP スライド アダプター II にコピーします。XEO ファイル。ファイルを保存して、このジオメトリ ファイルをセルの位置で更新します。[自動化] タブをクリックし、[新規] を選択して新しい自動実行を作成します。表示されたサンプル領域をドラッグしてセルを選択し、右クリックして分析リストに追加します。自動実行を保存し、[自動実行の開始]をクリックして取得を開始します。この図は、単一細胞MALDI-2質量分析プロファイリングにより、異なる脳領域全体および脳領域内の脂質ベースの細胞の不均一性がどのように明らかになるかを示しています。一様多様体の近似と投影、または UMAP 分析により、脳領域によって細胞が分離され、線条体、海馬、および皮質の異なるクラスターが形成されました。ライデンクラスタリングにより、4つの脂質ベースの細胞亜集団が明らかになりました。さらに、クラスター特異的な脂質シグネチャが観察され、注釈付き脂質全体で異なる強度プロファイルが観察されました。6つの皮質細胞からの質量スペクトルも、スライド全体で一貫した脂質検出を示しました。さらに、異なるスライドの皮質細胞は重複する UMAP 分布を示し、バッチ効果が最小限であることを示しています。