高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

私の研究室では、唾液や涙腺の加齢に伴う変化が、フローサイトメトリーと単細胞RNAシーケンシングを用いて異なる細胞タイプにどのように影響するかを研究しています。標準的な解離法は、老年した唾液や涙腺から脆弱な上皮細胞を十分に回収できません。そして私のプロトコルは細胞の生存率を向上させ、信頼性の高い単一細胞解析と細胞選別を可能にします。

まず、安楽死したマウスを解剖台に仰向けに配置します。細かい鉗子とハサミを使って、目と耳の間の皮膚を切開します。皮膚を優しく引き戻して涙腺を露出させます。

鈍い鉗子を使って、涙腺を少し持ち上げます。周囲の結合組織を円を描くように優しく引き離し、慎重に分離します。涙腺の目に見える境界を特定し、耳下腺を含む隣接組織から分離します。

その後、涙腺を氷の上で2ミリリットルの冷たいPBSを入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。解剖顕微鏡の下で残った脂肪を取り除き、結合組織のカプセルを慎重に涙腺から取り出します。滅菌された35ミリのペトリ皿を氷の上に置きます。

皿の中央に800〜1000マイクロリットルの冷たいPBSを加え、1つの涙腺をPBSに移します。組織がPBSに浸かっていることを確認してください。2本の滅菌メスを使い、涙腺を細かく細かく刻み、柔らかいペースト状の質感にします。

組織の断片は皿の片側に集めます。残留PBSを吸引し、新鮮な冷水PBSを1ミリリットルで洗浄します。洗浄された組織断片を、1ウェルあたり2ミリリットルの予温消化培地プレートに移します。

皿を揺らす水槽に入れ、37度・60回転毎分で30分間孵化します。広口径の1ミリリットピペットの先端を使い、組織を15回優しく擦砕します。皿をシェイクウォーターバスに戻し、さらに30分間孵化させます。

次に、通常の1ミリリットルのピペットチップを使い、サンプルを10回優しく研磨し、再度30分間培養します。その後、サンプルを10回優しくトリチーし、細胞懸濁液を2ミリリットルのドルフィンマイクロ遠心分離管に移します。プレートの各ウェルに1ミリリットルの冷却ブロッキング培地(BM1)を加え、残留細胞を含む消化培地を回収し、次の工程までプレートを氷の上に置きます。

細胞懸濁液を含むチューブを300Gで4度Cで5分間遠心分離します。各チューブから上清液を捨てます。残留細胞を含むプレートの各ウェルから対応するチューブにBM1を移します。

次に、各ウェルに600マイクロリットルの冷水BM1を加え、残りのセルをすいで洗浄し、ウォッシュを対応するチューブに移してセル懸濁液と結合させます。セルの懸濁液を優しく再懸垂させます。チューブを再び300Gで4度Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。

細胞ペレットにアキュターゼを1ミリリットル加え、細胞を優しく再懸浮させます。チューブを37度・毎分60回転で5〜10分間孵化します。1ミリリットルのピペットチップを使い、サンプルを優しく10回乾燥させます。

次にチューブに冷たいBM2を1ミリリットル加え、アキュターゼを希釈して酵素反応を終わらせます。チューブを300Gで4度Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。200単位/ミリリットル濃度のDNase 1を含む培地をチューブに加え、細胞を再懸浮させてチューブの上部まで満たします。

チューブを室温で10分間孵化し、5分後に1回優しく再懸浮させます。その間に、70マイクロメートルのセルストレーナーを15ミリリットルの円錐形チューブの上に置き、ストレーナーに1ミリリットルのBM3をあらかじめ湿らせます。培養後、細胞懸濁液をストレーナーに移します。

元の採取チューブにBM3を1ミリリットル加えてすすいで、同じストレーナーに移します。ストレーナーをさらに5ミリリットルのBM3で洗います。最後に、トリパンブルー染色と自動細胞カウンターを用いてろ過細胞懸濁液の細胞濃度と生存可能性を測定します。

その後、単一細胞RNAシーケンスによる遺伝子発現プロファイリングや、フローサイトメトリーを用いた蛍光標識細胞集団の細胞選別など、次の応用を進めます。単細胞RNAシーケンシングデータのUMAP解析により、尿水体における上皮および間質集団、すなわち筋上皮細胞や線維芽細胞、ならびに多様な免疫細胞集団が特定されました。老化した涙腺には豊富な血漿とIGHMおよびIGHDを発現する活性化されたB細胞が含まれていました。

シーケンシャルフローサイトメトリーゲートにより、EpCAM陽性かつGFP陽性の筋上皮細胞とEpCAM陰性GFP陽性の壁細胞を明確に分離しました。PDGFRアルファを発現するGFP陽性線維芽細胞はEpCAM陰性であり、上皮細胞との識別が可能でした。PDGFRアルファおよびEGFPマウスでは、すべてのGFP陽性細胞もコラーゲン1を発現し、線維芽細胞の同一性を確認しました。

フローサイトメトリー解析の結果、GFP陽性細胞の99.6%がPDGFRα免疫染色細胞に対応していることが示されました。このプロトコルは、上皮細胞、気質体、免疫集団の分子特性解析のために、涙腺から生存可能な単一細胞を分離することを目的としています。主な課題は、脆弱な老化組織の解離時の機械的および酵素的ストレスを最小限に抑えつつ、単一細胞RNAシーケンスにおいて高い細胞生存率を維持することです。

この手順により、単離細胞は単一細胞RNAシーケンシング、バルクRNAシーケンシング、特定の細胞集団の分子プロファイリングに利用可能です。選別された細胞は下流の機能的アッセイのために培養することも可能です。