シロイナナズナ核における単一分子局在顕微鏡の効率的なプロトコル

私の研究は、超分解能顕微鏡を用いたシロイナズナ核におけるクロマ質組織のエピゲノム編集と可視化に焦点を当てています。既存の手法はSTORMイメージングには適応されていません。このプロトコルは核の純度、標識の整合性、試料のマウンティング、イメージング安定性の向上に寄与します。

これは、シロイナドプシス・タリアナや他の植物系に適用され、核組織、クロマチン構造、エピジェネティクスを高解像度で研究します。まず、6ウェルの培養プレートをフームフードの下に氷の上に置きます。固定液は体積あたり4%、メタノール安定化ホルムアルデヒド0.1%、トリトンX100、PBSを混ぜます。

各フュームフード下の井戸に約4ミリリットルの氷冷固定液を加えます。発芽から8日から15日の間にあるシロイヌズナスの苗を、清潔な鉗子を使って、半強度のムラシゲとスクーグ、またはMS培地から取り除きます。すぐに苗を固定液に浸し、1井戸あたり約20本の苗を植えます。

サンプルごとに十分な材料を得るために3つの井戸を使用します。プレートを氷で満たした真空チャンバーに入れて閉じます。マイナス0.6バールからマイナス0.8バールの間で15分間真空サイクルを施し、閉じ込められた空気を取り除き、固定剤が植物組織に深く浸透できるようにします。

そしてゆっくりと真空を解放します。サンプルを混ぜてさらに15分間真空をかけます。フルームの下で、ピペットで固定液を除去します。

それぞれのウェルを3回、10分間、5ミリリットルの氷のように冷たいPBSで優しくかき混ぜて洗います。洗車後はPBSを取り外します。鉗子を使って固定組織を120×120ミリのペトリ皿に移し、固定苗に50マイクロリットルの核殻分離バッファーを加えます。

刃物で固定された組織を切り取る。同じ刃で、刻んだ組織をペトリ皿の一端にこそげます。核分離バッファー600マイクロリットルを加え、刃に付着した組織を洗い流します。

組織スラリーを2ミリリットルのドーンス均質チューブに移し、小さい乳棒で5回から10回ストロークします。次に、大きな棒でチューブ内で滑らかに動くまでストロークし、通常は5〜10回のストロークが必要です。均質化されたサンプルを30マイクロメートルのメッシュフィルターで50ミリリットルのチューブに通します。

ろ過液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。加速と減速の両方で、800Gのサスペンションを10分間遠心分離します。遠心分離後、緑色の組織の破片の間に小さな白いペレットが見えます。

上清液を廃棄し、ペレットを600マイクロリットルの核分離バッファーに再懸浮させます。800Gで再び遠心分離機で10分間、上澄液を取り除きます。緑色の残骸を完全に洗い流した後、分離された核の懸濁液を最大1週間4度の温度で保存し、所望の抗体で核に免疫染色します。

1.5%の重量/体積で低溶度のアガロース溶液を90度で1分間加熱し、粉末を溶かして透明な溶液を得る。完全な混合を保証するために一時的に渦を巻きます。溶液を冷やし、37度に保温してからグルコース酸化酵素バッファーの熱変性を防ぎます。

低融点アガロース溶液が37度に達したら、低融点アガロースに100ミリモラーメルカプトエチルアミンとグルコース酸化酵素緩衝剤を加えて最終濃度の1倍にし、STORMバッファーを優しく混合します。核混合物10マイクロリットルを、オゾン処理済みの1.5Hカバースリップに浸食し、紫外線オゾン浄化システムで20分間処理します。核がカバースリップに沈着するまで3分間待ちます。

その後、余分な液体を取り除き、2分間待ちます。準備済みの低融点アガロースをカバースリップに10マイクロリットル加え、すぐに顕微鏡スライドで覆います。カバースリップはシリコーンシーラントでシールしてください。

マイクロピペットの先端を使って、小さなペトリ皿に同量の溶液Aと溶液Bを混ぜます。混合物をカバースリップの縁に塗り、サンプルを密封します。シリコーンシーラントを5分間硬化させます。

サンプルスライドを顕微鏡に取り付けてピントを見つけてください。原子核を見つけて焦点を合わせる。長時間の取得時に安定性を確保するために、利用可能な場合はフォーカス維持モジュールを起動してください。

再構築中のドリフト補正を改善するために、1つまたは数個のナノダイヤモンドが原子核近くに配置される領域を選択します。2色イメージングの場合は、まず長長チャネルで取得し、その後短波長チャネルに切り替えて完全なイメージングを行います。ThunderSTORMで生画像スタックをガウスフィッティングと加重最小二乗推定を用いて処理し、再構成画像を生成します。

シグマに基づくフィルタリングと30ナノメートル未満の不確実性を適用し、正確な位置定位を保ちノイズを除去します。最後に、ThunderSTORMのクロスコレレーションまたはCOMETアルゴリズムを用いてサンプルドリフト補正を行い、再構築画像の最小ドリフトを確認します。核は、AF647結合二次抗体で免疫標識し、Hoechst H33258で対色した15日齢の野生型実から単離されました。

共焦点画像では、染色中心と核小体が明確に区別できる、最小限の破片で分離された良好に保存された複数の核が示されました。染色中心や核小体からRNAポリメラーゼIIシグナルは存在しませんでした。回折限定最大強度投影と対応するSMLM再構築により、RNAポリメラーゼIIおよびDNA標識の構造的詳細が明らかになり、より細かい構造を示す拡大された関心領域が明らかになりました。

シグマと不確実性に基づく局在フィルタリングにより、RNAポリメラーゼIIおよびDNAシグナルの定義が検出された局在化よりも向上しました。そして、ドリフト補正後のさらなる改良により、この改善された構造が維持されました。シグマ値に基づくフィルタリングにより、過度に小さいまたは大きなフィッティング幅のローカライゼーションが除去されました。

フーリエ環相関解析により、AF647チャネルの解像度はフィルタリング後に90.1ナノメートルから47.7ナノメートルに向上し、JF549チャネルは56.6ナノメートルから27.9ナノメートルに向上しました。核の完全性を維持しつつ、破片や背景蛍光を最小限に抑えることは、高品質な単一分子イメージングを実現するために極めて重要です。将来の研究では、核構造が環境的または発生的条件下で遺伝子調節と結びつくことが可能である。