の細胞特異的な分析

この手順の全体的な目的は、葉から細胞種特異的なプロトプラストの集団を単離することです。まず、葉の特定の細胞種でGFPを発現する植物を育成します。次に、葉を採取し、酵素消化を用いてプロトプラストを調製します。

次に、プロトプラストをろ過し、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて分取します。最終ステップとして、蛍光顕微鏡を用いて分取の正確性を確認します。最終的に、分取されたプロトプラストは、細胞型特異的な遺伝子発現の解析、プロテオーム解析、またはメタボリックプロファイリングに使用することが可能です。

蛍光活性化細胞分級（FACS）は、これまで根に対してはうまく利用されてきましたが、ここでは葉細胞の単離に用います。本手法を用いる前のGFP標識は、クロロフィル蛍光による干渉があるため制限されてきました。細胞分級中に起こり得る広範な生理学的変化を最小限に抑えるには、迅速かつ慎重なサンプル調製が不可欠であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、セルソーターの設定方法や、正確に分取できているかを確認する方法が分からないため、困難に直面することがあります。本手法は、植物システム生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。葉のような複雑な多細胞器官において遺伝子調節ネットワークを特定する際の問題は、細胞種によって発現する遺伝子群が異なることです。

この遺伝情報は、葉全体の採取分析において失われます。ここではその手順を実演します。私の助手として、当研究室で本作業の技術支援を行うEllison AsとSanjeev Kumaが同行します。まず、プロトプラスト分画酵素および転写・RNA阻害剤を含む溶液Aを20 milliliters、直径9 centimeterの丸型ペトリ皿に満たします。

次に、ここに示すサンプルなどのように、単一の葉以上のサンプルを含む場合に、目的の葉の材料を採取します。葉を最大15枚まで重ねて配置します。その後、カミソリを使用して、葉を1 mm幅の帯状に切断します。

フラットピンセットを用いて、葉のストリップを速やかにペトリ皿に移します。ストリップをゆっくりと分離させ、その後、サンプルを2回、各回5分間真空浸潤させます。次に、ペトリ皿を室温で90 RPMに設定したオービタルシェーカーに置き、3〜4時間プロトプラスト化させます。インキュベーションの間、30分おきにピンセットで葉のストリップを互いに分離させてください。

消化後、プロトプラスト溶液を70 micronのセルストレーナーを用いて50 milliliterチューブに穏やかにろ過します。これにより、葉のストリップが除去され、ストレーナーに保持されます。プロトプラストはろ過されてチューブに回収されます。

次に、4 mLの溶液Aを用いて葉のストリップを穏やかにすすぎ、洗浄液を50 mLチューブで回収します。その後、プロトプラスト懸濁液を丸底チューブに移し、室温、300 ×gで5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を可能な限り丁寧に吸引し、その後、同様の遠心条件で5 mLの溶液Aを用いてプロトプラストを洗浄します。

最後に、上層の浮遊物を除去した後、カット済みのP 1000チップを使用して、ソート直前に適切な量の溶液Aでプロトプラストを再懸濁します。カットしていないP 1000チップを使用して、プロトプラスト溶液中の凝集塊を分散させます。さらに、50 µmのナイロンフィルターを通してプロトプラストをソーティングチューブにろ過し、細胞をさらに分散させます。

次に、細胞サンプリングノズルの詰まりを防ぐため、細胞懸濁液を適宜希釈します。最適なサンプリング条件を決定した後、488 nmのアルゴンレーザーを用い、580/30バンドパスフィルターの出力と530/40バンドパスフィルターの出力を比較して、GFP陽性のプロトプラストを特定します。GFP陽性のプロトプラストは、530 nmが高く、580 nmが低い集団として現れることに留意してください。

低 530、低 580 の集団にある非 GFP プロトプラストに対し、死滅または死にかけているプロトプラストおよびデブリは高 580 の集団に現れます。蛍光顕微鏡によるソート済みプロトプラストの視覚化のため、ソート後のプロトプラストは直接 8 倍量以上の溶液 A にソートしてください。その後、遠心分離によりプロトプラストを濃縮します。プロトプラストを 8 倍量の溶液 A にソートし、回収して蛍光顕微鏡で観察することで、濃縮を確認できます。最初の画像は、孔辺細胞で GFP を発現する TP 382 細胞株の濃縮例を示しています。本手法を用いて得られた増幅前後の収量の例をこの表にまとめます。

500 picogramsから50 nanogramsの間で得られた量は、ovation PICO WTAシステムによる増幅、およびそれに続く定量PCR、次世代シーケンシング、またはマイクロアレイによる分析に十分な量です。次の一連の画像は、上述の方法で単離および分取された、さまざまなプロトプラスト細胞株を示しています。これらの最初のプロトプラストは、KC 2 74の葉の横断切片から派生したものです。

葉の観察により、GFPが維管束で発現していることが示されています。これらのプロトプラストはKC 4 64の葉から単離されており、KC 4 64の葉の横断面では、A dal表皮にGFPの発現が認められます。最終的に、これらのプロトプラストはTP 3 82の葉から誘導されたものであり、TP 3 82の葉において確認されました。

ここでは孔辺細胞でGFPが発現しています。580±30 nmと530±40 nmのバンドパスフィルターからの出力を示す、典型的なFACS取得ドットプロットが表示されています。示されているソーティングゲートは、通常ソーティングに使用されるものです。

阻害剤なしでプロトプラスト化したcoal fourの葉由来プロトプラストのこの最初のドットプロットは、530低値、580低値の単一の集団を示しています。一方、阻害剤存在下でプロトプラスト化した野生型coal fourの葉由来プロトプラストのこのドットプロットは、阻害剤によるストレスと脱色によって生じる580蛍光のシフトを示しています。これらのドットプロットは、それぞれKC seven four、KC 4 64、およびTP 3 82系統の葉由来プロトプラストのものです。

これらのサンプルを阻害剤の存在下で分析したところ、GFPが高530・低580の集団に含まれていることが示されました。この代表的な定量的PCR実験では、まず各分画タイプからサンプルを回収しました。その後、Ovation PICO WTAシステムと定量的PCRを用いてサンプルの増幅を行いました。

GFP特異的プライマーを用いて解析を行いました。表示されている値のうち、赤色は最高値、緑色は最低値を示しており、actin 2をリファレンス遺伝子として用いた平均値または単一値は黄色の水平バーで示されています。これらの結果は、分取した画分中のGFP細胞含量に関する光学的な評価を再検証したものです。

530高 580低の集団は、測定可能なGFP発現レベルが最も高いことを示しました。一方で、530高 580高の集団は、GFP発現が約1000倍低く、530低 580低および530低 580高の集団は、コントロールの葉全体および未分別のプロトプラスト集団と同程度の低いGFP発現レベルを示しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、植物から分別の完了まで4〜5時間で終えることができます。この手順を行う際は、分別の精度を維持するために、常にセルソーターを監視し、必要に応じて再校正することが重要です。

本手順を確認しました。異なる細胞型における遺伝子発現レベルを比較・対照するために、マイクロアレイ解析などの他の手法を用いることも可能です。本手法の開発により、現在は異なる発達段階における特定の葉細胞型での遺伝子発現を解析しており、これを農学プロジェクトで得られた葉全体のデータと比較する予定です。

このビデオを視聴することで、蛍光活性化細胞分染（FACS）を用いて葉の単一細胞型を単離する方法について、十分に理解することができます。