シンクロトロンX線トモグラフィを用いたサブミクロン分解能を持つ非侵襲的3次元可視化
2008年5月27日
我々は、非侵襲的に0.7μmのピクセル解像度での3D断層データセットを生成するために欧州放射光施設（ESRF）でシンクロトロンX線トモグラフィーを使用。ボリュームレンダリングソフトウェアを使用して、これは組織学的切片によって生成された人工物のない自然の状態で内部構造の再構築が可能になります。
こんにちは。私はチューbingen大学のBats LabのMichelle Ovです。このプレゼンテーションでは、サブミクロン分解能のシンクロトロンX線トモグラフィーを用いた、微小緩歩動物（クマムシ）の内部組織の非侵襲的な三次元可視化についてお話しします。私たちが研究対象としているモデルシステムは、輪形動物の*Aus Long osis*で、体長800 µmから1 mmの微小緩歩動物です。こちらは当研究室の培養個体を撮影した写真で、動物が藻類を食べている様子が見て取れます。
Argosの内部組織を研究するために、SRFおよびGrableにおいてシンクロトロンX線放射線を用いてトモグラフィVOXデータを生成しました。ここでは、巨大なストレージリングを備えたESRFの写真と、リングの外側に位置するID 19の実験ホール（右上隅）を示しています。測定にあたり、試料を臨界点まで調整し、瞬間接着剤を用いてプラスチックピンに固定しました。実験は20.5 KEVで実施され、再構成のために1,500枚の投影画像を取得しました。
ここでは、CCDチップ、14ビットのダイナミックレンジ、および400万画素を備えたカメラを示しています。この写真の下部に示されているシミュレーターは、X線を可視光に変換します。これはサンプルホルダーと回転テーブルの接写です。
ビームに対してサンプルを適切に配向させるため、サンプルをGoyaメーターヘッドに装着します。実験系の詳細な記述については、Journal of Microscopyに掲載された2007年の論文をご参照ください。本プレゼンテーションでは、ソフトウェアFiji Studio Maxを用いた3次元視覚化に関するデータアナライザーに焦点を当てます。
まず、サンプル情報を抽出するために、背景からグレー値をどのように除去するかを説明します。ヒストグラムには1つの大きなピークが見えますが、これは主に背景のグレー値に由来するものです。ヒストグラムからこのピークを除去すると、グレーの立方体からサンプルが現れるのが確認できます。
次に、キーフレーム作成ツールVG studioを使用してオブジェクトを回転させる方法を説明します。Maxには、定義済みのカメラ軌道セットが用意されています。ここではXYサークルを使用して垂直軸Xsを中心に回転させます。これが最終的なアニメーションになります。
動物の背面にある大きな構造は、瞬間接着剤の表面に対応しています。それでは、サンプルの内部組織を3次元的に観察するために、仮想的な切断平面を設定する方法を説明します。切断平面は、前方、側方、および軸方向の3つの方向で設定可能です。
ここでは前断面を使用し、動物の中央付近の領域にある切断位置を決定します。この切断平面は固定されている必要はありません。再びキーフレーマーを使用することで、任意の軸に沿って移動させることができます。この例では、プリセットクリップZを使用して、サンプルの長軸方向に沿って切断平面を移動させています。これにより、最終的なアニメーションが段階的に作成されます。わずか0.7 micronsの分解能で、すべての内部構造の3D組織を視認し、追跡することができます。
あらかじめ定義されたカメラ軌道以外に、ユーザー固有のカメラパスを作成することも可能です。作成するには、「フリーカメラ・ルックアット（free camera look at）」モードを選択し、カメラおよび仮想レンズの焦点距離を任意の位置に調整します。ステップバイステップで新しいカメラ位置を定義することで、どのような複雑さの個別パスにも対応させることができます。
左上の3Dウィンドウでは、すべてのカメラ設定の効果をリアルタイムで確認できます。最後の例では、動物内の完全な消化系を辿るバーチャルフライトを体験します。ここでは、gma、colliery、labrum、およびrotellaの一部をご覧いただけます。
さらに近づき、動物の口に入ります。ここでは、背面にある PHN を確認できます。次に、食道を通り、腹腔へと進みます。
このリベットダニには、2つの大きなkerがあります。これらは消化機能を備えたスライク構造です。右のseumに入ります。
小さな開口部を通して、多数のIDE細胞を確認できます。これらの細胞は消化において重要な役割を果たしていますが、その完全な機能とメカニズムはまだ完全には解明されていません。心室に戻ると、心室と結腸の境界に、先ほど心室への進入に使用したIsal弁という特定の構造が見えます。
凝縮され、萎縮した膜に囲まれた食塊（フードボルス）が見えます。食塊の後方には、排泄物パレット（フェーカルパレット）が確認できます。現在、この排泄物パレットの中を通過しています。
その後、短い結腸（inter colon）を通過し、後結腸（post colon）に入ります。ここでは、大きく特徴的な微生物相が見られます。最後に、ここでは、まるでパレットのような、この動物特有のプレートの内表面を確認することができます。
消化器系の解説を終わります。最後に、動物の腹側外面を短く確認し、腹側付属肢（AAL）プレートと生殖プレートを見ていきましょう。
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概要
本研究では、放射光X線トモグラフィーを用いて、マイクロAHR出力の内部構造を可視化する非侵襲的な手法を提示します。この技術により、従来の組織学的手法に伴うアーティファクトを排除した、高解像度の3Dイメージングが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- 微生物学
背景
- Micro AHRの出力物は小型の生物であり、詳細な内部解析が必要です。
- 従来のイメージング手法では、真の構造を不鮮明にするアーティファクトが導入される可能性があります。
- シンクロトロンX線トモグラフィーは、高解像度による解決策を提供します。
- 本研究では、モデル生物としてダニの Aus Long osis に焦点を当てています。
研究目的
- マイクロAHR出力の内部構造を可視化するため。
- 放射光X線トモグラフィーの有効性を実証するため。
- これらの小型生物の構成に関する知見を提供するため。
使用方法
- 欧州シンクロトロン放射光施設（ESRF）におけるシンクロトロンX線トモグラフィー。
- サンプルは臨界点乾燥させた後、イメージング用に固定した。
- イメージングは20.5 KEVで行い、1,500枚の投影画像を撮影した。
- データの再構成にはボリュームレンダリングソフトウェアを使用した。
主な結果
- ピクセル解像度 0.7µm で3Dトモグラフィーデータセットを作成した。
- 内部構造を自然な状態で再構成した。
- この手法により、組織切片作成によるアーティファクトを効果的に回避できた。
- 可視化によって、微小AHR出力の構成に関する新たな知見が得られた。
結論
- シンクロトロンX線トモグラフィーは、非侵襲的なイメージングのための強力なツールです。
- この手法により、微小な生物学的構造への理解が深まります。
- 今後の研究では、生物学におけるさまざまなアプリケーションにこの手法を活用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
サブミクロン分解能を持つ非侵襲的な3D可視化により、破壊的な切片作成を行うことなく、マイクロスケールの生物学的システムの詳細な内部構造解析が可能になります。このアプローチは、自然状態での定量的な形態学的データを提供することで、初期探索段階におけるターゲットのバリデーションおよびメカニズムのリスク低減を支援します。本手法は、サンプルサイズや作製時のアーティファクトにより従来の組織学的な解析が困難な疾患関連モデルにおいて、表現型スクリーニングやアッセイ開発の予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：微小節足動物モデルにおける内臓器官系の3D再構築により、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：希少または限定的なサンプルに対して非破壊的なイメージングを提供し、後続の解析に向けた材料の保存を可能にする。
- 予測的価値：切片作成によるアーティファクトなしに、機能解剖学および組織構成を可視化することで、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 0.7µmのピクセル解像度を持つ定量的な形態学データセットを生成し、精密な表現型解析および構造比較を可能にします。
- 運用の価値： キーフレームによるカメラ軌道と仮想切断面を用いることで、標準化および再現可能なボリュームレンダリングワークフローを実現します。
- アッセイへの適用性： 完全な器官系（例：消化管）の可視化を促進し、バイオマーカーの選定や機能的読み出しの設計に役立てます。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：アニメーション化された3D視覚化により、疾患に関連するシステム内の内部構造の縦断的な追跡が可能になります。
- メカニズムによるリスク低減：潜在的な解剖学的特徴（細胞内構造や弁機構など）を明らかにし、病態生理学的経路を解明します。
- 前臨床段階での整合性：モデルシステム全体でアーティファクトのない構造的検証を提供し、リスクを調整した上での推進判断をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、サンプル調製後、機能解析アッセイの開発前に行う非破壊的なイメージングステップとして初期の探索ワークフローに組み込まれ、ターゲット検証試験の反復的な設計を可能にします。
- 探索生物学：微小規模の生物学的システムの内部組織を明らかにすることで、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：細胞内解像度を必要とするハイスループット・コンテンツスクリーニングプラットフォームに適した、定量的な3D出力を提供します。
- アナリティクス：形態計測上のランドマークの抽出および体積測定を可能にし、実験条件間での統計的比較を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：機能的表現型と相関するネイティブ状態の構造データを提供し、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：微生物モデルシステムにおけるプロジェクト横断的な応用のための、再利用可能なイメージング能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織学的アーティファクトを排除し、本来の微細構造を維持することで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用的価値：標準化された放射光プロトコルとソフトウェア主導の可視化パイプラインを通じて、再現性を高めます。
- 戦略的価値：リード候補モデルにおける構造異常の早期検出を可能にすることで、開発後期の失敗リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：疾患関連マイクロモデルにおける信頼性の高い定量的な構造データにより、go/no-go判断に根拠を与えます。
実施上の検討事項
- 放射光安全管理、トモグラフィ再構成、およびボリュームレンダリングソフトウェア（例：Fiji、VG Studio Max）に関する専門知識が必要です。
- 20.5 keVでのサブミクロン分解能イメージングが可能なビームラインを備えた放射光施設（例：ESRF）へのアクセスに依存します。
- 試料調製（臨界点乾燥、マウント）およびイメージングパラメータ（1,500投影、回転プロトコル）について、チーム間での標準化が必要です。
- 微小節足動物の種によって異なる試料密度、角質層の硬度、およびマウント媒体への適合性の検討が含まれます。
- 試料サイズの制約（<1 mm）および、長時間のビーム照射中に放射線安定性を維持した標本が必要であるという制限があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:18
Introduction
0:38
X-ray radiation tomographic measurements
2:08
Removing the background and extracting the sample information
2:38
Rotating the object using the keyframer
3:25
Setting the virtual plane
4:06
Moving the slice through the object using the keyframer
4:45
User specific camera paths
5:23
Following the digestive system through the whole animal
