好中球単離プロトコル

好中球分離プロトコル。この手順では、全血サンプルから白血球を抽出します。使用機器は遠心分離機とバイアルです。ボルテックスミキサー、針および注射器、シリンジフィルターを使用します。

MilliporeブランドのMX GV 0.22 µmフィルターを使用します。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を用いた好中球の分離には、2種類のHBSS溶液が必要です。塩化カルシウムを含むHBSSを用いて、ヒト血清アルブミンを含む溶液を調製します。

好中球の懸濁および洗浄には、塩化カルシウムを含まないHBSSを使用します。本手順では、適切なHBSS溶液を使用するように特に注意してください。ヒト血清アルブミン（HSA）は、pHおよび血漿浸透圧を維持する血漿中のタンパク質です。

bovine serum amalgamate red cell lysis bufferは使用しないでください。本製品はRoche Diagnostics社によって製造されています。好中球分離用培地NIM（Cedar Line Labs社製）およびLymph light Poly分離培地を使用してください。最良の結果を得るために、光を避け、冷蔵庫で保管してください。すべての試薬は、使用時に室温に戻しておく必要があります。

実験の1時間前に試薬を冷蔵庫から出しておく。好中球分離用のHBSS-HSA溶液を調製する。塩化カルシウム含有HBSSをバイアルにピペットで分注する。

HSAをシリンジに吸い取ります。気泡が入らないように注意してください。シリンジの針を取り外し、フィルターに交換します。

フィルターを通してHSAをHBSSバイアルに注入し、ボルテックスで2回混合します。他の材料の準備が整い室温になったら、全血を約15 mL採取します。これにより、10⁸個の好中球を含む10〜15 mLのサンプルが得られます。ドナーは、血液サンプルの採取前24時間は、アルコールや市販薬を摂取していない必要があります。

これらは分離プロセスを妨げる可能性があります。全血は、血液9部に対してK3EDTA、クエン酸ナトリウム、またはヘパリンを1部の割合で添加するか、あるいは製造元の指示に従ってヘパリンを添加することで、抗凝固処理を行うことができます。本手順では、以下のステップについて説明します。

血漿と単球を分離して除去します。赤血球を溶血させ、赤血球を含まない好中球層を分離して回収し、一次分離した好中球を懸濁させます。NIM層から好中球を回収します。

遠心分離管に分離培地を5 mL分注します。遠心分離によって血液が培地を通過して下方へ押し下げられるため、分離培地を管の底の方に配置することでフィルターとして機能させます。きれいな分離を行うため、NIMの上に血液5 mLを慎重に重層します。

溶液が混ざり合わないよう、細心の注意を払ってください。遠心分離による混合を防ぐため、ピペットチップを分離ゲルの表面に近づけ、ゆっくりと慎重にこの操作を行ってください。500 RCFで35分間遠心分離します。

20～25°Cにおいて、血液は6つの明確な層に分離されるはずです。これら6つの層は、血漿、単球、分離媒体、好中球、さらに分離媒体、そして最下層の赤血球ペレットです。これらの6つの層が明確に分かれていない場合は、分離プロセスが適切に行われなかったことを意味し、再度実施する必要があります。

分離不良の一般的な原因としては、分離培地の劣化、ドナーによる過去72時間以内のアルコール摂取、あるいはタイレノールやアスピリンなどの他の薬剤の服用が挙げられます。血漿、単球、および分離培地の層を注意深く取り除き、廃棄してください。これらの層は密閉可能なチューブに入れ、慎重に廃棄します。その後、好中球の層および好中球より下の分離培地をすべて、きれいな遠心管に注意深くピペットで移し、可能な限り多くの好中球を回収してください。

下層の分離培地を少量含めるように採取するのが最も効率的なことが多いです。底部のペレットを乱さないようにしてください。次に、好中球層を精製します。

カルシウム不含HBSSを用いて、好中球溶液を10 millilitersに希釈します。チューブを数回転倒混和して細胞を懸濁させ、好中球溶液を遠心分離します。

350 RCFで10分間遠心分離します。20〜25°Cにおいて、好中球および残留赤血球を含む赤色のペレットがチューブの底部に形成されます。ピペットを用いて上清を除去します。

底部のペレットを乱さないように注意しながら、赤血球を溶血させます。

サンプル中の赤血球を溶血させて除去する必要があります。残存する赤血球を溶血させるため、赤血球溶血バッファー 2 mL をチューブに加えて再懸濁させます。ペレットを懸濁させ、バイアルをボルテックスミキサーの設定 3～4 で撹拌してください。

好中球が活性化する可能性があるため、ボルテックスの設定を4以上に上げないでください。ペレットを溶解させるために、数秒間ボルテックスにかけるか、パルス操作を行う必要がある場合があります。溶解液を250 RCFで5分間遠心分離します。

サンプルの損傷を最小限に抑えるため、ソフトスタートオプションを使用します。ピペットで上清を除去します。溶解工程を繰り返します。

必要に応じて好中球懸濁液を回収するため、各チューブにカルシウム不含HBSSを500 µL加えます。ペレットを強度3～4でボルテックスし、カルシウム不含HPSSを用いて10 mLに希釈します。250 RCFで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。

ペレットを 250 µL の HSA 含有 HBSS 溶液で再懸濁します。通常、1 mL あたり 2×10⁶ 個の好中球が回収されます。