メチル化DNA免疫沈降

このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のプロトコルを実演します。これは、メチル化DNAをバイアスのない方法で特異的に単離するために用いられる手法です。哺乳類におけるDNAメチル化は、シトシンのC5位へのメチル基の付加によって特徴付けられます。

CpGジヌクレオチドに存在するDNAメチル化は、正常な発生およびいくつかの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たす可逆的なエピジェネティックマークです。DNAメチル化の正常な機能には、女性におけるX染色体の不活性化、反復配列のサイレンシング、ゲノムインプリンティング、およびゲノム安定性の維持が含まれます。また、DNAメチル化は、癌、de Willebrandt-Callaman症候群、エンゲルマン症候群、免疫不全・セントロメア不安定性・顔面異常症などの数多くの疾患においても役割を果たすことが示されています。

例えばがんにおいて、プロモーターの異常な高メチル化は、重要ながん抑制遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性があります。一方で、不適切な低メチル化は染色体の不安定化や癌遺伝子の活性化を招きます。まず、DNAを300から1000塩基対のサイズの断片に超音波破砕することで処理を行います。次いで、超音波破砕したDNAを95°Cで変性させます。

5-メチルシトシンを認識する一次抗体を添加し、メチル化されたDNA断片に結合させます。磁性ダイナビーズに結合させた二次抗体を用いて、一次抗体が結合したDNA断片を単離します。非メチル化断片を除去し、プロテイナーゼで抗体を消化します。

KAフェニルクロロホルムによるクリーンアップで消化されたタンパク質を除去し、沈殿させることでDNAを精製します。これにより、メチル化断片が濃縮されます。精製後のDNAは、PCRマイクロアレイやシーケンシングなどのアプリケーションに使用できます。通常、この工程は2日間の手順として行われます。

1日目は、DNA調製、超音波処理による免疫沈降、およびタンパク質消化を行います。2日目は、メチル化濃縮DNAを精製および単離するため、pHクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行います。準備には、シリコン処理済み遠心チューブ、DNA超音波処理装置、一次抗体（抗5-メチルシトシンマウスモノクローナル抗体）、二次抗体（羊抗マウスIgG結合ダイナビーズ）、およびマグネティックチューブラックなどの特殊な材料が必要です。

Meetupプロトコルの最初のステップは、DNAの調製です。事前にDNAの性質を評価することが不可欠です。サンプルの正確な定量は極めて重要であり、DNA量を決定するさまざまな方法は、望ましくないDNA種の存在によって悪影響を受ける可能性があるため、サンプルDNAの状態（主に二本鎖か一本鎖か）を把握しておく必要があります。

2本鎖DNA量は、NanoDrop 3, 300を用いた分光光度法により容易に評価できます。1.5 µLをロードし、測定タイプを核酸に設定して、計算式にDNA 50を選択し、1.5 µLの水で機器を初期化します。ペデスタルを清掃し、1.5 µLの液体でブランク測定を行います。サンプルを溶解させ、ペデスタルを清掃してからサンプルの1.5 µLをロードし、測定ボタンを押します。

濃度が提示され、それを利用できます。必要なマイクロリットル数を算出してください。ここではA260/A280比が1.8であることが理想的です。1 µgのサンプルを調製します。

しかしながら、わずか200 nanogramsのサンプルであっても、良好な結果を得るには十分です。まず、DNAサンプルを清潔なシリコン処理済みチューブに入れます。その後、最終容量が50 microlitersになるまで滅菌水を加えます。

DNAの非特異的な吸着およびタンパク質のチューブ壁への付着を防ぐため、DNAのソニケーションおよび免疫共沈降はシリコン処理済みチューブを用いて行う必要があります。DNAの調製後、サンプルをソニケーションします。免疫共沈降はDNA断片が短い方が効率的なため、ソニケーションによるDNAの断片化が必要です。サンプルをソニケーターにセットし、出力設定を「high」に、時間を「30 seconds」に設定します。30秒間のオンとオフを繰り返す設定にし、ベース部分の充填線まで4°Cの水を満たしてください。

サンプルを7分間ソニケーションします。ソニケーションが完了したら、チューブを取り出して氷上に置きます。想定されるサンプルのDNAサイズに合わせて、あらかじめソニケーション条件を最適化しておくことが重要です。

例えば、部分的に分解されたDNAサンプルの場合、超音波処理時間を短くする必要があります。超音波処理の結果は、標準的な電気泳動法で可視化できます。この段階では、後の工程で使用するために、300から1000 base pairsの長さのDNA断片を得ることが望ましいです。

マイクロアレイおよびPCRアッセイでは、DNAの5分の1を入力用またはリファレンスDNAとして確保しておく必要があります。この場合、超音波処理したDNA 800 nanogramsを免疫沈降に使用し、残りをリファレンスDNAとして取り分けておきます。メディアプロトコルの次のステップは免疫沈降（IP）反応です。一次抗体を添加する前に、DNAを変性させる必要があります。一次抗体は一本鎖DNAに対して感度が高いため、変性が必須となります。

サンプルを95 °Cのウォーターバスに10分間置きます。変性ステップが完了したら、直ちにチューブを氷上に移し、少なくとも5分間保持します。これにより、変性したDNAの再アニールを防ぎ、サンプルの冷却後に抗体が最適に結合するようにします。

チューブを短時間遠心し、内容物を底に集めます。次に、一次抗体を添加します。使用する抗体量は、バッチごとおよびメーカーごとにタイトレーション（力価決定）して調整してください。

本ケースでは、5 µgの一次抗体を加え、次に免疫沈降バッファー（IPバッファー）を加えて最終的に500 µLにします。次に、IP DNAをローテーターに設置し、4 °Cで2時間インキュベートします。インキュベート中のチューブ内での抗体の凝集を防ぐため、回転させる必要があります。

一次抗体のインキュベーションが完了する約15分前に、磁性ダイナビーズの洗浄と調製を行います。まず、バイアル内のビーズをボルテックスミキサーで十分に再懸濁させます。次に、30 µLのビーズを清潔なシリコン処理チューブに移し、そのチューブを多検体用マグネットラックに設置します。

反応1回につき30 µLのビーズを分注します。ピペッティング誤差や不注意によるビーズの損失に備え、1回分多く用意してください。例えば、8回の反応を行う場合は、9回分に相当する270 µLのビーズを取り出します。

磁気ビーズは磁気ラックの壁側に引き寄せられます。ビーズが移動し、チューブの壁面に明確な筋となって定着するまで2分間待ちます。次に、ピペットのチップで壁面のビーズを乱さないよう注意しながら、上清を慎重に吸引して廃棄します。

上清を過剰量のIPバッファーに置き換え、ボルテックスした後、再びマグネットラックに2分間置きます。この洗浄操作をもう一度繰り返し、洗浄後のビーズを元の量のみのIPバッファーで再懸濁します。インキュベーションが完了したら、ローテーターからサンプルチューブを取り出します。

免疫沈降を完了させるには、30 µLの洗浄済みビーズを反応液に加え、チューブを再びローテーターに戻し、4 °Cで2時間静置します。このインキュベーション中に、抗マウスIgGである二次抗体が一次マウス抗体に結合します。抗マウス抗体はマグネティックDynabeadsにコンジュゲートされており、これにより結合した生成物の回収と、それに続く精製ステップを容易に行うことができます。

両方の抗体によるインキュベーションが完了したら、IPチューブをマグネットラックに2分間置きます。この時点で、メチル化DNAは一次抗体によって結合し、一次抗体はさらにdyna bead結合二次抗体によって結合されています。上清を除去して廃棄し、500 µLのIPバッファーで置換します。

チューブの内容物を混合し、ラックに戻して2分間静置します。この洗浄工程をIPバッファーを用いてもう一度繰り返します。最後の洗浄後に上清を除去し、ビーズを最後に再懸濁します。

400 µLの消化緩衝液に、100 µgのproteinase Kを加えて反応させ、50 °Cで一晩インキュベートします。proteinase K処理は、抗体タンパク質およびDNAに関連する残存タンパク質を消化し、メチル化DNAを溶液中に放出させるために必要です。DNA精製は、手順の2日目に行います。インキュベーターから消化チューブを取り出します。

ドラフトチャンバー内で、pH 7のフェノール・クロロホルム等量混合液 500 µLをチューブに加え、十分にボルテックスします。13,000 ×gで10分間遠心分離します。界面を乱したり有機層を除去したりしないように注意して、チューブから上層の水相を慎重に取り出します。水相を新しいチューブに移します。

界面が濁っている場合は、2回目の抽出を行うことがあります。次に、3 M 酢酸ナトリウムを10分の1量、この場合は 40 µL 加えます。ペレットの回収を容易にするためのキャリアとして、1 µL のグリコーゲンを使用しても構いません。

チューブをボルテックスして内容物を混合します。次に、2倍量の100% ethanolを加え、ボルテックスした後、-20 °Cのフリーザーで20分間凍結させます。凍結後、沈殿したDNAを遠心分離機を用い、13,000 G、4 °Cで20分間遠心分離して回収します。

チューブの底にDNAペレットが形成されます。遠心分離機からチューブを取り出し、エタノールを除去します。この際、チューブ底部のペレットを乱さないように注意してください。

残留エタノールを除去するために、パルススピンが必要な場合があります。ペレットを洗浄するには、冷えた70%エタノールを500 µL加え、ボルテックスした後、13,000 G、4 °Cでさらに20分間遠心分離します。2回目の遠心分離が完了したら、70%エタノールをパルススピンし、残留エタノールをピペットで除去します。

ペレットを乾燥させ、残りのエタノールを蒸発させるため、チューブをキャップ開けた状態でラックに置いておきます。最後に、メチル化濃縮DNAのみを含むペレットを10 µLの滅菌水で再懸濁し、使用前にDNAペレットが十分に溶解するまで時間を置きます。PCRを用いて回収効率を検証することが推奨されます。

これは、正常ヒトDNAを増幅するためのプライマーを用い、メチル化されたDNA断片と非メチル化されたDNA断片をそれぞれ異なる産物として増幅するように設計したPCR反応を行うことで実施できます。H 19インプリンティング制御領域は、メチル化されていないゲノム領域を増幅するように設計されたプライマーと併せて使用することが可能です。プライマー配列およびPCRサイクリング条件の例は、付属のプロトコルに記載されています。

この時点で、ミートアッププロトコルの最初に取り分けておいたインプットDNAまたはリファレンスDNAを回収する必要があります。PCR反応の一組はインプットDNAを用いてセットアップし、もう一組はメチル化が濃縮されたIP DNAを用いてセットアップします。ミートアップが成功していれば、IP PCRではメチル化プライマーを用いた場合に産物が生成され、コントロールプライマーを用いた場合には産物が生成されません。

逆に、入力PCRではメチル化および非メチル化の両方のDNA断片が含まれているため、両方のプライマーを用いて産物が生成されるはずです。メチル化断片が濃縮されたDNAは、PCRシーケンシングやマイクロアレイ解析などの多くのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

他の分子生物学的手法と組み合わせることで、メチル化プロファイリングやエピゲノミクスの研究を目的として、特定の遺伝子座またはゲノム全域におけるDNAのメチル化状態を解析することが可能です。