改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

この手順では、まず100倍の倍率でピペットチップを研磨フィラメントの近くに配置します。次に、空気圧と加熱を開始します。フィラメントを操作します。

ピペットチップが膨張し、鈍角な形状のチップになります。加熱を停止して、チップの開口部を小さくします。再度、圧力と加熱を停止します。

こんにちは。スタンフォード大学分子・細胞生理学部のMiriam Goodman博士の研究室に所属しているBrandon Johnsonです。本日は、パッチピペットのプレッシャーポリッシングの手法について解説します。当研究室では、C. elegansニューロンのイオンチャネルや膜パッチの研究にこの手法を用いています。

それでは始めましょう。6〜10本のパッチピペットを用意します。詳細は、専門家に相談するか、プログラマブル・プラーを用いたパッチピペットおよび鋭利電極の作製に関する視覚化実験を参照してください。

手順を開始するために、圧縮空気ラインの圧力を約 40 PS.I に設定します。次に、圧縮空気ラインを4方制御バルブに接続します。プラスチックチューブを4方バルブに接続し、チューブの自由端に高圧ピペットホルダーを取り付けます。研磨にはマイクロフォージ装置を使用します。

LA Scientific社のCcpm twoキットを使用します。この装置には、高圧ピペットホルダー、フットペダルで制御される白金加熱フィラメント、および低倍率（10倍）と高倍率（100倍）の作動距離の長い空気対物レンズを備えた顕微鏡が搭載されています。プロトコル中にピペットの開口部を観察できることが極めて重要であるため、作動距離の長い対物レンズが理想的です。

次に、圧力バルブがオフの状態であることを確認します。その後、ピペットをピペットホルダーにセットし、ラボの安全のため、フィッティングを指で締め付けます。ピペットがピペットホルダーにしっかりと固定されていることを確認してください。

そうしないと、気圧によってピペットがホルダーから飛び出してしまう可能性があります。オプションのステップとして、静電容量を減少させノイズ特性を向上させるために、ワックスなどの疎水性絶縁剤でピペットをコーティングすることができます。次に、ピペットをホルダーにセットし、マイクロフォージを顕微鏡ステージ上に配置して、ピペットの先端と研磨用フィラメントの両方が、マイクロフォージの10倍の低倍率で確認できるようにしてください。

チップをフィラメントから約50 µmまで近づけ、次に高倍率の100倍対物レンズに切り替えます。このとき、ピペットチップと研磨用フィラメントの両方がピントが合い、視野に入っている必要があります。入っていない場合は、フィラメントの高さを調整してください。ピペットの位置は調整できないため、ピペットチップとフィラメントが視野の両端に位置するように配置してください。

フィラメントは加熱されると膨張し、ピペットに接触する可能性があるため、ピペットチップをフィラメントに近づけすぎないようにしてください。チップとフィラメントが適切に配置されたら、バルブを回して加圧空気をピペットに送り込み、チップ後方のテーパー部分が外側に膨らみ始めるまでピペットチップを加熱します。チップが過度に膨張する前に加熱を停止してください。

目的の形状を得るためには、適切な距離、熱量、および時間を決定するための試行錯誤が必要です。オプションの工程として、チップの開口径を小さくするために、圧力をかけずにチップ先端を研磨することも可能です。また、これらの研磨工程は、微調整のために繰り返し行うことができる点に留意してください。

ピペットチップの形状と寸法を調整します。研磨が完了したら、圧力を遮断し、ピペットチップを安全な方向に向けてください。

ピペットを取り出し、ほこりが付かないように清潔な保管ボックスに収納してください。研究室の安全のため、ピペットを取り外す前に必ず圧力をオフにしてください。そうしないと、ピペットホルダーからピペットが飛び出す可能性があります。

以上で、パッチクランプ記録の精度を向上させるためのピペットのプレッシャーポリッシングの手順について説明しました。この処置を行う際は、気化した金属がピペットに付着するのを最小限に抑えるため、ポリッシングコイルを高融点ガラスでコーティングすることが重要です。また、ピペットが加圧空気にさらされている間は十分な注意を払ってください。

ピペットがホルダーにしっかりと固定されていることを確認し、ホルダーから取り出す前にエアをオフにしてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。

プレッシャーポリッシングがうまくいくこと、そして実験の成功を願っております。