パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

ガラスキャピラリーピペットは、単一細胞電極穿孔法、DNAマイクロインジェクション、パッチクランプ電生理学など、多種多様な手法において研究室で広く普及しています。記録用のガラスキャピラリーパッチクランプ電極を準備するには、プログラマブルプラーを用いてケイ酸塩ガラスを延伸します。電極の先端にワックスをコーティングした後、先端を火炎研磨し、今後の使用のために保存します。こんにちは、スタンフォード大学分子細胞生理学部門のミリアム・グッドマンです。

このビデオでは、電気生理学で使用するパッチクランプピペットとシャープ電極の作製方法を実演します。ピペットとも呼ばれるガラス微小電極は、数十年にわたり電気生理学の基盤となってきました。現在、これらのピペットはプログラマブルプルヤーを用いてガラスキャピラリーから作製されています。

それでは始めましょう。パッチクランプピペットを作製するために、清潔で埃のないSutter borosilicate capillariesと、Sutter P-97 flaming ground micro electrode pullerを使用します。適切なプルプログラムを開発するには、Sutter's Pipette Cookbookが優れたリファレンスになります。

まず、プラーのダストカバーを持ち上げます。次に、ボックスからガラスキャピラリーチューブを1本取り出します。埃の蓄積を最小限に抑えるため、必ず蓋を閉めてください。

次に、片手でキャピラリーをフィラメントの一方の側の溝にスライドさせ、クランプを軽く締めます。このとき、クランプはチューブが脱落しない程度に締め、かつ溝の中にスライドさせられる程度の緩さを維持してください。その後、同じ側にあるスプリングメタルストッパーを解除します。

次に、親指と人差し指で、両方のキャリアの底に取り付けられている金属タブを掴みます。もう一方のバネ式金属ストッパーを解除します。キャリアを限界まで引き寄せ、片手でその状態を保持します。

次に、チューブをフィラメントハウジングに通し、反対側にあるキャリアの溝に差し込みます。この際、ガラス管を加熱フィラメントに押し付けないように注意してください。両側のクランプを締めて固定します。

キャリアを固定するのに十分な強さで締め付けますが、ガラスが潰れないように注意してください。次に、ダストカバーを閉じて緑色のボタンを押します。パッチクランプ記録用のマーク付き電極ピペットは、各ステップで熱と速度を下げ、最終ステップで小さな極を形成する5段階のポーリングプログラムを用いて作製されます。

このプログラムでは、熱と重力を利用します。鋭い電極を作成する手順は非常に似ていますが、この場合は、外径 1 mm、内径 0.78 mm の Warner Instruments 製薄いガラスキャピラリーを使用します。また、プルイングプログラムが終了した際には、熱と重力に加えてモーターを使用するプルイングプログラムを適用します。

ダストカバーを持ち上げ、両方のクランプを緩めて、完成したピペットを取り出します。次に、ピペットを作業用ボックスに入れます。このボックスは、プラスチック製ピペットチップボックスのラックにフォームストリップを接着し、フォームに6〜8本の切り込みを入れることで作成できます。

ピペットをスリットに挿入します。ボックスにピペットがいっぱいになったら、火炎研磨の手順に進み、ピペットを火炎研磨します。火炎研磨を開始する前に、フットペダルで制御される白金加熱フィラメントを備えたマイクロフォージ装置をセットアップしてください。

まず、静電容量を減少させノイズ特性を改善するため、ピペットに歯科用ワックスをコーティングします。この操作を行う際は、溶けたワックスを少量、近くに用意しておきます。ワックスがチップ内部に侵入しないよう、ピペットの背面から空気圧をかけます。

次に、チップを液体ワックスに短時間浸します。その後、取り出してください。ピペットを研磨装置にセットし、チップの先端をフィラメントから約50 micronsの距離まで近づけます。

加熱時にフィラメントが膨張することに留意してください。1〜2秒間の短い熱パルスを加え、ピペット先端からワックスを除去し、ガラス面を滑らかにします。顕微鏡下でピペットチップを観察し、開口径と平滑度を確認してください。

標準的なパッチクランプ記録には、チップ開口部の直径が1〜3 µmである必要があります。粗いもの、不均一なもの、または不規則な形状のチップは廃棄してください。完成したピペットは、ホコリから保護するために必ず蓋を閉めてワーキングボックスに保管してください。この手順を繰り返し、10本の良好なピペットを作成します。以上で、プログラマブル・プラーを用いたパッチクランプ用ピペットおよびシャープ電極の作製方法について説明しました。

同様の手順を用いて、パッチクランプで最適な結果を得るための注入針など、さまざまなガラス器具を作製することができます。実験当日に、ほこりの付着していない新しいピペットを引き、実験の1時間以内に研磨することが重要です。また、目視でピペットが滑らかに研磨されていることを確認してください。

opus oocytesに発現させたイオンチャネルのパッチクランプ記録法のデモンストレーションを収録した別のビデオもぜひご覧ください。以上で終了です。これであなたはピペットの専門家となりました。実験の成功をお祈りしています。