환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

이 절차는 5 µm 및 3 µm 필터를 통한 사전 여과 후 0.22 µm 필터에 포집하여 해수 샘플로부터 해양 미생물 바이오매스를 획득하는 것으로 시작합니다. 그다음 0.22 µm 필터에 잔류한 생물체로부터 총 RNA를 추출합니다. 선택적 효소 분해 및 감산 하이브리드화(subtractive hybridization)를 통해 총 RNA에서 rRNA를 제거하고, polyA tailing과 인비트로(in vitro) 전사를 통해 농축된 Mr.N을 선형적으로 증폭합니다.

증폭된 antisense RNA는 이후 random hexamer를 사용하여 이중 가닥 cDNA로 전환됩니다. 이렇게 생성된 cDNA는 클로닝 및 시퀀싱을 하거나 직접 pyro sequencing을 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 대학교 해양과학과의 Marianne Moran 박사님 연구실의 Rachel Persky입니다.

오늘은 환경 샘플의 유전자 발현을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 환경 메타전사체학(environmental meta transcriptomics)을 이용하는 방법입니다. Scott Gifford가 RNA 수집을 위해 환경 샘플을 처리하는 방법을 시연하겠습니다.

샘플과 Johanna RIN에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드리겠습니다. AON이 RNA 제거 과정을 시연할 것입니다. 이어서 Maria Kosta가 RNA 증폭 및 cDNA 합성 단계를 설명하겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 환경 RNA 수집을 시작하기 위해, 튜브의 한쪽 끝을 샘플링하고자 하는 수심의 물속에 넣고 반대쪽 끝을 고용량 3 µm 필터에 연결하며, 펌프를 두 튜브 끝 사이에 배치하여 필터 라인 시스템을 구축합니다. 그 다음 3 µm 필터를 0.22 µm 필터 타워에 연결하고, 0.22 µm 타워에서 나오는 유출수는 눈금 실린더로 향하게 합니다.

시스템을 세척하기 위해 수 리터의 물을 통과시킵니다. 세척이 끝나면 펌프를 가동하는 상태에서 튜브를 물에서 제거하여 라인에 남아 있는 물을 모두 배출하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 0.22 micrometer 필터를 필터 타워에 장착하고 닫습니다.

라인의 끝부분을 다시 물속에 넣고 펌프를 켭니다. 두 필터 모두에서 공기가 완전히 빠져나가도록 하고, 카보이에 표시된 여과된 물의 부피를 모니터링합니다. 원하는 부피만큼 여과가 완료되면, 라인을 물에서 제거하고 시스템에 남아 있는 물을 배출합니다.

필터가 마르는 즉시 상단 필터 플레이트를 빠르게 제거하고 필터 페이퍼를 접습니다. 필터를 휠 팩(whirl pack)에 넣고 액체 질소로 급속 냉동합니다. 실험을 시작하기 전, RNA는 어디에나 존재하며 mRNA는 빠르게 분해되므로, 작업대와 피펫을 포함하여 리보뉴클레아제 프리(ribonuclease free) 환경에서 작업하기 위한 표준 주의 사항을 반드시 준수해야 한다는 점에 유의하십시오.

이러한 점을 고려하여, 본 절차에 사용되는 모든 재료를 다룰 때는 깨끗한 장갑을 착용해야 합니다. 또한 시료는 가능한 한 짧은 시간 내에 처리해야 합니다. 0.22 µm 필터에서 총 RNA를 추출하기 위해, 50 mL 원심 분리관에 beta-mercaptoethanol이 첨가된 RLT buffer 8 mL를 넣어 비드 비팅 튜브를 준비합니다.

그런 다음 mobile power soil extraction kit의 RNA beads 1~2 mL를 첨가합니다. 냉동실에서 냉동된 필터를 빠르게 꺼내 world pack에 넣은 상태를 유지합니다. 망치로 이를 잘게 부숩니다.

분쇄된 필터를 준비된 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고 파라필름이나 실험용 테이프로 튜브 뚜껑을 밀봉한 후 10분 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 50 milliliter 튜브를 5,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 실온에서 용해물(lysate)을 가능한 한 많이 제거하여 15 milliliter 튜브로 옮긴 후 다시 5분 동안 원심 분리합니다.

5,000 ×g에서 원심분리한 후, 상층액을 새로운 50 milliliter 튜브로 옮기고 용해물에 1부피의 100% ethanol을 첨가합니다. 10 milliliter 주사기를 사용하여 18~21 gauge 바늘을 통해 용해물을 빨아들였다가 다시 내보내는 과정을 약 5회 반복합니다. 이후의 추출 단계에서는 제조사의 지침에 따라 KaiGen R and easy mini kit를 사용하며, 진공 매니폴드나 반복적인 원심분리를 통해 용해물을 제공된 컬럼에 적용합니다.

분광 광도법으로 총 RNA 양을 정량합니다. 총 RNA 수율을 결정한 후, 제조사의 지침에 따라 Ambien turbo DNA free kit를 사용하여 DNA 오염물을 제거합니다. RNA 추출이 완료되었으므로, 이제 Johanna에게 총 RNA를 전달하여 1차 및 2차 rRNA 제거 단계를 수행하도록 하겠습니다.

감사합니다, Rachel. rRNA 제거를 시작하려면 사용 전 10배 농축 반응 버퍼를 부드럽게 섞어 짧게 원심 분리한 후, 멸균된 RNA-free 0.5 mL 튜브에 10배 농축 반응 버퍼, RNA 억제제, 총 RNA 샘플 및 terminator exonuclease를 적절한 부피로 혼합하십시오. Epicentre 프로토콜에 따라, 가열 덮개가 있는 써모사이클러 또는 항온 수조에서 반응물을 30 °C로 60분 동안 배양하십시오.

다음으로, 먼저 RNAs free water를 추가하여 총 부피를 200 µL로 맞춘 후, mRNA 원심분리기에 1:1 페놀-클로로포름 용액을 1부피 추가하여 페놀-에탄올 침전법으로 반응을 종결합니다. 수층을 수집한 후 100% 에탄올과 염으로 침전시킵니다. 이 단계는 잠정적인 중단 지점입니다.

RNA는 후속 분석에 사용할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 1차 mRNA 농축을 완료한 후, 제조사의 지침에 따라 Ambien microbe enrich 및 microbe express 키트를 사용하여 샘플 내의 잔류 rRNA를 제거합니다. 진핵생물 rRNA의 제거를 용이하게 하기 위해 microbe enrich 키트를 사용합니다.

모든 부피는 제조사의 지침서를 참조하여 결정합니다. 먼저 피펫을 사용하여 1.5 mL 튜브에 300 µL의 결합 완충액을 넣습니다. 여기에 최대 30 µL 부피에 담긴 5~100 µg의 총 RNA를 첨가하고 볼텍싱합니다.

5 µg RNA용 캡처 올리고 믹스 2 µL를 결합 버퍼에 조심스럽게 넣고 튜브를 가볍게 탭합니다. 혼합물을 짧게 원심 분리합니다. 혼합물을 70 °C에서 10분 동안 변성시킨 후, 37 °C에서 1시간 동안 어닐링합니다.

이 배양 과정 동안, oligo mag beads를 nuclease free water로 한 번, binding buffer로 한 번 세척하고 세척 단계 사이에 비즈를 마그네틱 스탠드로 포집하여 준비합니다. 비즈는 얼음 위에 보관하다가 실온에서 가온합니다. 사용 5분 전에 세척액을 히트 블록에서 37 °C로 가열합니다.

세척된 oligo mag beads에 RNA capture oligo mix를 추가하고, 튜브를 부드럽게 섞은 후 원심분리합니다. 혼합물을 37 °C에서 15분 동안 짧게 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 약 3분 동안 기다린 후, mRNA가 포함된 상층액을 흡입하여 얼음 위에 놓인 수집 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 포획된 비드에 미리 데워둔 세척액 100 µL를 첨가합니다. 포획된 비드를 가볍게 볼텍싱하고 상층액을 회수합니다. mRNA가 포함된 이 상층액을 얼음 위에 놓인 수집 튜브에 옮깁니다.

ambi microbe express kit를 사용하여 잔류 원핵생물 rRNA를 제거하기 전, 수집 튜브를 얼음 위에 놓으십시오. Bioanalyzer 또는 Experion을 사용하여 rRNA 오염 여부와 mRNA 품질을 확인합니다. 이 단계는 잠정적인 중단 지점입니다.

RNA는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. rRNA가 제거되면, 제조사의 지침에 따라 Ambien message AMP two bacteria kit를 사용하여 mRNA를 증폭하겠습니다. 이제 순수한 mRNA 샘플이 준비되었으므로, mRNA 증폭 및 cDNA 합성을 안내할 Maria에게 실험을 넘기겠습니다.

감사합니다, Hannah 씨. mRNA 증폭을 시작하기 전에, Ambien message AMP two bacteria kit 마스터 믹스의 각 성분 부피를 계산하십시오. 우선, 최대 1000 nanograms의 총 RNA를 멸균된 RNA-free 마이크로 원심분리관에 넣어 템플릿 RNA의 polyadenylation을 시작합니다. 체외 전사를 통해 RNA를 합성하기 위해 첫 번째 버퍼에 6.5 microliters의 샘플을 사용하고 RNA-free water는 넣지 마십시오.

균일한 온도를 유지하기 위해 하이브리다이제이션 오븐이나 인큐베이터를 사용하는 것이 권장됩니다. 또한 튜브 내부에 응축수가 형성되지 않는 것이 매우 중요하므로, 14시간 동안의 in vitro transcription 반응 배양을 강력히 권장합니다. RNA 수율을 극대화하여 가장 높은 A RNA 수율을 얻으려면, 최종 반응 부피 40 µL로 IBT를 수행하고 A RNA를 약 10 µL씩 나누어 -80 °C에 보관하십시오.

RNA 증폭이 완료되면, 상보적 DNA 또는 cDNA를 합성할 차례입니다. Promega universal ribot Clone cDNA 합성 시스템 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성합니다. 이 키트는 2 µg의 RNA를 cDNA로 전환하는 지침을 제공합니다. 저희는 6~10 µg의 RNA를 투입하고 그에 따라 반응 규모를 조정할 것을 권장합니다.

에탄올 침전법 또는 Promega Wizard DNA cleanup 시스템을 사용하여 cDNA를 정제합니다. 제조사의 지침에 따라 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오. 이 시점에서 이중 가닥 cDNA를 직접 시퀀싱할 수 있습니다. 10 L의 해수로부터 약 10 µg의 환경 RNA를 추출하고 20배로 증폭하였으며, 증폭된 mRNA를 이중 가닥 cDNA로 전환하여 환경 전사체의 시퀀싱 및 분석에 충분한 양의 물질을 생성하였습니다. 지금까지 환경 메타전사체학을 이용하여 해양 미생물 군집의 유전자 발현을 평가하는 방법을 살펴보았습니다.

본 절차를 수행할 때 mRNA는 빠르게 분해되며 RNA는 어디에나 존재한다는 점을 항상 유념하십시오. 따라서 RNase-free 환경에서 작업하기 위한 표준 예방 조치를 취하고 샘플을 최대한 신속하게 처리하십시오. 이것으로 모두입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.