Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

안녕하세요, 제 이름은 Ena입니다. 저희 실험실에서는 정기적으로 유전자 발현 프로파일링을 수행하고 있습니다. 저희는 이 기술을 사용하여 meth와 야생형(wild type) 사이의 차등 발현 유전자를 모니터링합니다. 오늘은 야생형과 meth RNA 샘플을 준비했으며, 먼저 cDNA 합성을 진행하겠습니다.

간접 표지법을 사용하며, 이 기술의 장점은 직접 표지 시 발생할 수 있는 실험자 편향(eye bias)을 방지하는 것입니다. 이를 위해 RNA 샘플을 준비하여, 총 부피 13 µL 내에 3 µg의 RNA를 확보합니다. 여기에 random hexamer 2.5 µg을 추가합니다.

RNA의 변성을 위해 샘플을 75°C에서 8분 동안 배양합니다. 이제 AM L-D-L-D-U-T-P 컨티뉴 믹스, 역전사 효소 버퍼 및 RT 프라이머가 포함된 역전사 칵테일을 첨가하고 가볍게 탭핑합니다. 그 후 샘플을 42°C에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간이 지나면 샘플을 꺼냅니다.

이제 튜브에는 cDNA와 RNA 혼합물이 들어 있습니다. 여기서 우리가 수행할 작업은 수산화나트륨과 EDTA를 첨가하여 RNA를 가수분해하는 것입니다. 수산화나트륨의 최종 농도는 100 mM이어야 하며, EDTA의 최종 농도는 5 mM이어야 합니다.

이제 샘플을 65 °C 항온수조에서 10분 동안 배양하겠습니다. 배양이 완료되었으므로, 최종 농도가 500 M이 되도록 pH 7 HEPES 완충액을 첨가하여 샘플을 처리합니다. 이 단계에서 샘플을 -20 °C에 보관하거나 바로 정제 단계를 진행할 수 있습니다.

cDNA 정제를 위해 KaiGen PCR purification kit를 사용합니다. 하지만 Bush buffer와 ion buffer에 프리징 현상이 있으므로, 자체적으로 phosphate wash buffer와 phosphate ion buffer를 준비합니다. PPI 300 µL를 추가한 후, 혼합물을 컬럼으로 천천히 파이펫팅하여 옮깁니다. 그리고 최고 속도로 1분간 원심분리합니다. 준비한 phosphate wash buffer 750 µL를 추가하고, 다시 한번 1분 동안 원심분리합니다.

모든 펠렛을 확실히 회수하기 위해 다시 원심분리하겠습니다. 그리고 이 튜브들을 빈 원심분리 튜브로 옮기겠습니다. 여기에 pH 8.5의 4 M 인산칼륨이 포함된 phosphate E buffer 30 µL를 추가하겠습니다.

여기서는 모든 시료가 컬럼 중앙에 추가되었는지 확인해야 하며, 상온에서 1분 동안 배양합니다. 따라서 다시 1분 동안 원심분리하고, 30 µL의 zero buffer를 추가하여 상온에서 배양합니다. 그 다음 컬럼을 제거하면 총 60 µL의 CDA 부피가 됩니다.

cDNA 정제가 완료되면 -20°C에서 보관하거나, 건조 후 보관할 수도 있습니다. 따라서 cDNA를 동결 건조할 수 있습니다. 이제 튜브에는 변형된 건조 cDNA가 들어 있습니다. 이제 이 건조된 샘플을 다음 용액에 현탁하겠습니다.

샘플을 pH 9의 15 $\mu$L bicarbonate 용액 10 $\mu$L에 현탁하겠습니다. 이 단계에서는 튜브를 위아래로 섞어주는 방식으로 진행하며, cDNA를 충분히 재현탁하는 것이 매우 중요합니다. 형광 표지자는 빛에 민감하므로, 결합 반응은 암실에서 진행해야 합니다.

하지만, 생명과학 분야에서 이를 선택하면 개별 패키지로 제공됩니다. S5는 보라색 캡이고 S3는 오렌지색 캡입니다. 또한 S5는 현탁 시 시안색으로 나타나고 Cary는 마젠타색으로 나타납니다. 따라서 암실에서 이 샘플들을 염료 튜브로 옮긴 후, 염료를 다시 현탁하여 원래 가지고 있던 튜브로 다시 옮기겠습니다.

그 후 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간의 배양 후, pH 5.2의 100 millimolar sodium acetate 35 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 그 다음, 앞서와 유사한 정제 절차를 통해 세척합니다. 다만, 이번에는 Qiagen에서 제공한 세척 버퍼(wash buffer)와 용출 버퍼(elution buffer)를 사용합니다.

샘플을 넣는 위치를 설명한 후 기기를 세척해야 합니다. 이제 샘플이나 혼합물을 넣을 수 있습니다. 이것은 scifi로 표지된 샘플이며, 여기서 보이는 OD 260은 CDA 함량을, OD 650은 scifi의 D 통합 정도를 나타냅니다. 그리고 여기 제 side 3 표지 샘플이 있습니다.

다시 한번, 6가지 농도와 5개의 50 측정치 사이트 3 통합을 수행합니다. D corporation 작업이 효율적이므로, 이제 샘플들을 결합하겠습니다. 잠시 동안 혼합합니다. 그리고 이제 피드백을 사용하여 샘플을 다시 작성하겠습니다.

이제 슬라이드 처리 단계로, 슬라이드를 물 위에 올려 보편적으로 재수화시키면 반점들이 더 커지게 됩니다. 이를 보호하기 위해 100 °C에서 급속 건조시킨 후, 반점들을 슬라이드에 UV 하이브리드화 또는 UV 가교 결합시킵니다. 그 다음 준비된 프리 하이브리드 버퍼에서 배양합니다. 먼저 슬라이드를 아래 방향으로 놓되, 아직 물에 닿지 않게 합니다.

그리고 이 상태로 5분 동안 기다립니다. 이렇게 하면 상자가 더 커 보이고, 넣기 전보다 더 반짝거려야 합니다. 슬라이드를 100°C에서 건조시킨 후 응결 현상을 관찰합니다. 그리고 유이(youi)를 사용하여 가교 결합을 진행하겠습니다.

수화를 위해 슬라이드를 미리 데워둔 물에 담급니다. 이 과정은 매우 빠르게 진행해야 하는데, 그 이유는 연결되지 않은 모든 스팟이나 올리고뉴클레오타이드를 제거하는 것이 목적이기 때문입니다. 이 과정에서 속도가 너무 느리면 스팟에 꼬리 현상(com tails)이 나타날 수 있습니다.

따라서 매우 빠르게 수행해야 하며, 슬라이드를 물 밖으로 꺼내지 않도록 주의하십시오. 이 과정을 30초 동안 수행한 다음, 즉시 실온에서 5분 동안 원심분리기로 700 rpm에서 회전시킵니다. 이제 이 슬라이드를 미리 준비한 파이프 스테이션 완충액에 넣습니다. 슬라이드를 용기 속에 천천히 밀어 넣고 42°C에서 최소 45분 동안 배양합니다. 여기 하이브리드화할 건조된 샘플이 있습니다. 먼저 이를 물에 재현탁하겠습니다.

이 단계에서는 피펫팅을 통해 시료를 재현탁하며, 시료가 과도하게 노출되지 않도록 주의하십시오. 그 다음, 농도가 10 mg/mL인 sperm DNA 1.5 µL를 첨가합니다. 그리고 1.2 µM의 tRNA를 첨가합니다.

농도는 12.5 mg/mL이며, 비특이적 결합을 차단하기 위해 tRNA와 일부 정자 DNA를 첨가합니다. 여기에 5.35 µL의 20X SSC를 첨가하여 최종 농도를 3X로 맞춥니다. 마지막으로 1% SDS 3.5 µL를 첨가합니다.

이제 혼합물을 5분 동안 끓인 후, 최고 속도로 5분 동안 원심 분리하면 준비가 완료됩니다. 슬라이드를 배양한 지 한 시간이 지났으며, 현재 물과 이소프로판올이 준비되어 있습니다. 먼저 물에서 슬라이드를 흔들어 SDS를 제거한 다음, 이소프로판올로 세척하고 즉시 표준 게이지에 넣습니다.

여기서 건조를 방지하기 위해 슬라이드가 공기 중에 너무 많이 노출되지 않도록 주의하십시오. 따라서 하름스테이션 버퍼(harm station buffer)에서 바로 물로 옮겨 슬라이드를 세척합니다. 몇 분 동안 세척하되, 움직임이 옆으로 가지 않고 오직 위아래로만 이루어지도록 하십시오.

또한 슬라이드가 물 위에 떠 있지 않은지 확인하고, 즉시 이소프로판올(isopropanol)로 옮깁니다. 그 상태로 다시 몇 분 동안 둡니다. 그리고 상온에서 5분 동안 방치해 주십시오.

700 R.Cool. 이제 슬라이드도 하이브리드화 준비가 되었으며, 먼지로부터 보호하기 위해 슬라이드 박스에 보관하는 것이 좋습니다. 하베스트 스테이션을 위해 리프트 또는 슬립을 사용하겠습니다.

커버 슬립에는 흰색 스트립이 있어 적절한 높이를 확보해주며, 커버 슬립과 슬라이드 사이에 샘플이 들어갈 공간을 제공합니다. 이를 에탄올로 세척한 다음 내려놓으며, 이물질이 없는지 확인합니다. 먼저 인쇄 영역이 표시된 템플릿 슬라이드를 가져오고, 그 위에 준비한 슬라이드를 올려 정확하게 정렬되었는지 확인합니다.

완벽하게 정렬되었는지 확인하십시오. 그리고 스트립이 우리가 아래로 향하게 할 측면에 위치하도록 해야 합니다. 육안으로 확인하기 매우 어렵지만, 반드시 확인하시기 바랍니다.

그리고 슬라이드의 측면에 줄무늬가 있어야 합니다. 샘플은 측면에서 로딩할 것입니다. 소량의 샘플을 사용하므로, 먼저 15 µL를 취해 커버 슬립의 모서리부터 로딩하기 시작합니다.

그리고 천천히 당기면서 가장자리를 따라 이동해 모든 영역을 덮어줍니다. 이 단계에서는 기포가 생기지 않게 하는 것이 매우 중요하며, 슬라이드가 마르는 것을 방지하기 위해 15 µL의 migrator를 슬라이드 측면에 추가로 도포합니다. 이제 샘플이 준비되었으며, 하이브리드화(hybridizing)가 진행되는 동안 슬라이드에 수분을 공급하는 마이크로 채널이 있는 슬라이드 및 우선순위 챔버를 배양합니다.

그리고 3X SSC 10µL를 슬라이드의 여섯 모서리에 추가합니다. 챔버에는 여섯 군데, 즉 각 모서리와 각 측면에 자리가 있습니다. 커버슬립이 밀려나지 않도록 슬라이드를 매우 조심스럽게 옮기십시오. 슬라이드를 똑바로 놓으면, 미리 뿌려둔 물에 커버슬립이 밀착되는 것을 확인할 수 있습니다. 마지막으로 나사가 단단히 조여졌는지 확인하십시오.

반응 챔버를 65 °C의 워터배스에서 배양할 예정이지만, 바닥에 직접 닿게 하고 싶지는 않습니다. 따라서 과도한 열 전달을 방지하기 위해 일종의 플라스틱 차단막을 배치합니다. 그리고 챔버를 조심스럽게 놓고, 위치가 바뀌는 것을 방지하기 위해 적절한 무게추를 올려둘 수 있습니다.

이 배양 과정은 보통 10~12시간 동안 하룻밤 내내 진행됩니다. 슬라이스 세척을 위해 0.05% SDS가 포함된 1X SSC를 사용합니다. 이는 커버슬립을 제거하기 위한 단계입니다.

그리고 이것은 첫 번째 세척 단계에 사용됩니다. 그 후, 모든 SDS를 제거하기 위해 0.06% PBS로 두 단계 더 세척을 진행합니다. 이제 준비된 슬라이드를 가져와 용기 안에 아래를 향하도록 넣습니다.

그 다음 좌우로 살살 흔들어주면 커버슬립이 부드럽게 떨어지는 것을 확인할 수 있습니다. 이제 XES가 포함된 다른 세척 버퍼로 옮긴 후 1분 동안 기다립니다.

06 XSSC로 이동합니다. 모든 FDS를 제거했는지 확인하기 위해 한 번 더 반복하겠습니다. 실온에서 700 RPM으로 5분 동안 원심분리하여 건조합니다. 이 슬라이드는 빛에 민감하므로 슬라이드 박스에 보관하십시오.

이것은 슬라이드 스캐너이며, 여기에 슬라이드를 넣으시면 됩니다. 이 작은 공간에 슬라이드를 아래 방향으로 향하게 넣으십시오. 라벨은 이쪽을 향하게 하고, 두 번째 슬라이드에서는 스캔하려는 영역을 지정하기만 하면 됩니다. 슬라이드의 이 영역을 선택하십시오. 저희는 슬라이드 프린팅에 16핀을 사용했습니다.

따라서 각 블록은 하나의 핀에 대응하며, 저희 슬라이드에는 8,000개 이상의 스팟이 포함되어 있습니다. 그리고 유전자가 약 4,000개이기 때문에 vi 컬러 게놈을 두 번 표현합니다. 즉, 사용하는 각 올리고당마다 두 개의 스팟이 배정됩니다.

확대해서 보시면, 이 특정 실험에서 전사 조절 인자 돌연변이체와 야생형을 비교했음을 알 수 있습니다. 돌연변이체는 빨간색을 띠는 scifi로 표지하였고, 야생형은 초록색을 띠는 site three로 표지하였습니다. 따라서 이러한 반점들처럼 빨간색으로 보이는 부분은 돌연변이체에서의 전사체 양이 야생형보다 더 많았음을 나타냅니다.

따라서 이들은 빨간색이나 빨간색 계열로 나타나며, 초록색으로 보이는 부분은 야생형의 전사체 양이 돌연변이체보다 더 많았음을 나타냅니다. 그리고 노란색으로 보이는 지점은 해당 전사체가 돌연변이체와 야생형 모두에서 동일하게 존재했음을 나타냅니다. 즉, 두 색상이 겹치면 이 점들처럼 노란색으로 보이게 됩니다.