Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

Joof 유충의 신경근 접합부에서 안정적인 전기생리학적 기록을 얻기 위한 방법입니다. 먼저 기록 전, 유충을 해부하여 체벽, 근육 및 신경계를 노출시킵니다. 중추신경계(CNS) 기저부의 축삭은 복측 신경절 뒤쪽에서 절단합니다.

그다음 기록 전극을 대상 근육에 배치하고, 자극 전극을 신경 지배 운동 뉴런 근처에 배치합니다. 운동 뉴런의 절단된 축삭을 자극 피펫 안으로 흡입합니다. 이후 흥분성 접합 전위를 기록할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 생리학 및 세포 생물물리학과의 McCabe 연구실 소속 Wendy MLA입니다. 오늘은 GE lava의 신경근 접합부에서 시냅스 전도를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 시냅스 생리학과 신경 전도를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 위해, Wandering third stage 및 star larvae를 해부하여 체벽을 노출시킵니다. 이 프로토콜은 짧은 해부용 핀을 사용하여 전기생리학 실험에 맞게 수정되었습니다.

이들의 길이는 약 2~4 mm이며, 실험 중에 전극이 현미경 대물렌즈에 닿을 가능성이 더 낮습니다. 체벽을 노출시킨 후, 핀셋으로 CNS를 잡고 약간 들어 올립니다. 그런 다음 말초 신경 운동축삭을 절단하고 뇌를 제거합니다.

뇌를 제거한 후, 1mM calcium이 포함된 HL 3.1 완충액으로 해부된 표본을 두 번 세척하십시오. 해부가 완료되었으므로, 이제 유충의 근육 세포에서 세포 내 기록을 수행할 수 있습니다. 해부 플레이트를 전기생리학 현미경 위에 놓고 calcium이 첨가된 HL 3.1 완충액에 표본을 잠기게 하십시오.

그 다음 용액과 접촉하도록 배스 전극(bath electrode)을 고정합니다. 흡입 전극(suction electrode)은 근육에 분포하는 말초 신경을 자극하는 데 사용됩니다. 세포 내 전극을 근육에 배치할 때 진동이 발생하는 것을 방지하기 위해, 흡입 전극을 먼저 디시에 배치하십시오.

전극을 접시에 넣었다면, 6번 근육를 지배하는 운동 신경 근처에 위치시킵니다. 세 번째 복부 마디에서 절단된 신경이 유리 피펫 내부로 들어올 때까지 부드럽게 흡입합니다. 흡입 시 신경이 늘어나지 않도록 주의하십시오.

피펫을 약간 들어 올려 근육에 닿지 않게 합니다. 그런 다음 절단된 신경 섬유를 잡아당기지 않도록 위치를 조정합니다. 흡입 전극이 제자리에 놓이면, 세포 내 기록을 위한 기록 전극을 배치합니다.

3 M KCl로 채운 날카로운 미세 전극을 사용하십시오. 기록 전극을 6번 근육의 중앙 위에 위치시킵니다. 배양액에 대해 0이 되도록 입력 오프셋을 조정하십시오.

전극을 천천히 내리며 높은 광학 배율로 근육에 접근하여 전극이 근육 표면에 닿게 합니다. 근육에 성공적으로 삽입되었는지 확인하려면 오실로스코프를 관찰하십시오. 휴지 막전위는 최소 -60 mV여야 합니다.

이제 간헐적인 미세 플레이트 전위가 보여야 합니다. 기록 전극이 배치되면, 세포가 1분 동안 안정화되도록 둡니다. 기록을 시작하기 전, membrane potential의 변화를 감지하기 위해 axon HS two 헤드 스테이지와 axle clamp two B 증폭기를 사용하십시오.

Axle clamp 2B는 신호를 디지털화하는 digit data 1322 A를 통해 P clamp 소프트웨어가 실행되는 컴퓨터와 인터페이스됩니다. PC에서 막전위를 기록하십시오. clamp X 소프트웨어를 사용하여 운동 신경절(motor axon)에 자극을 가해 흥분성 막전위 또는 EPSP를 생성하십시오.

ejs가 생성되면, 자극 시냅스 없이 3분 동안 미니어처 ejs를 기록합니다. Soft mini 분석 소프트웨어를 사용하여 트레이스를 분석하고 mini EJP 진폭과 빈도를 결정할 수 있습니다. ejs를 생성하기 위해.

마스터 8펄스 발생기를 사용하여 운동 뉴런의 절단된 끝부분을 자극합니다. 발생기는 0.3 millisecond의 사각 전압 펄스를 전달하도록 설정합니다. 시냅스 회복을 위해 자극 사이에 5초의 간격을 둡니다.

NMJ에서 각 근육으로부터 최소 10개의 유발 전위를 기록하고 진폭의 평균을 구합니다. 이 그림은 유발 EJP 반응과 자발적 mini EJP가 나타나는 야생형 sal 유충의 6번 근육에서 기록된 전형적인 트레이스를 보여줍니다. 지금까지 초파리 유충의 신경근 접합부에서 cy 전위를 기록하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 3분에서 10분 이내에 해부를 완료하고 세포가 여전히 건강하고 반응성이 있을 때 즉시 전기생리학적 기록을 시작하는 것이 중요함을 기억하십시오.

해부가 너무 오래 걸리면 근육 세포의 휴지 막전위가 -60 millivolts 미만으로 떨어지며, 이는 기록하기에 너무 낮은 수치입니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.