에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

이 절차는 초파리를 배양하는 것으로 시작합니다. 모든 트랜스 레티놀(all trans retinol)이 포함된 먹이에서 적절한 유전자형을 가진 3령 유충을 기릅니다. 각 유충의 머리와 꼬리 부분을 핀으로 고정합니다.

그 다음 FLA를 평평하게 폅니다. 이어 뇌와 후방 신경을 절단하여 리듬감 있는 운동 활동을 중단시킵니다. 다음으로, 컨트롤 박스가 포함된 청색 LED 광원을 조절하여 표본에 초점을 맞춥니다.

마지막으로, 날카로운 전극을 사용하여 6번 근육을 찌릅니다. 그런 다음 전압원을 통해 빛 펄스를 가합니다. 안녕하세요, Brandeis University 생물학과 Dr. Leslie Griffith 연구실의 Nicholas Marstein입니다.

안녕하세요, Griffith 연구실의 Stefan Pulver입니다. 오늘은 초파리 유충의 신경근 접합부에서 channel rhodopsin 2를 이용해 시냅스 전위를 유도하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 초파리의 시냅스 생리학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

우리는 또한 이를 사용하여 학생들에게 시냅스 생리학을 가르치고 교육 실습을 진행합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 UAS channel redsin two와 3 7, 1 gal four 초파리 라인을 표준 초파리 배지가 들어 있는 별도의 병에서 유지하십시오.

3 7, 1 gal, 네 가지 초파리 라인에서 처녀 초파리를 수집하고, UAS channel redsin의 두 가지 라인에서 수컷을 수집하십시오. 다음으로, 1 mM의 all trans retinol(ATR)이 혼합된 초파리 배지를 만듭니다. 이를 위해 일반 초파리 배지를 전자레인지에서 약 1분 동안 녹입니다.

배지가 녹으면 약 30에서 60초 동안 식힌 후, 파리 배지 10 mL마다 100% 에탄올에 녹인 100 mM a TR 100 µL를 첨가합니다. a TR 배지가 담긴 바이알이 준비되면, 수집한 수컷과 암컷 파리를 각 바이알에 넣습니다. 바이알을 22에서 25 °C의 어두운 곳에 두어 파리가 교미하고 알을 낳게 하며, 3령 유충이 보일 때까지 4~5일 동안 기다립니다.

이 시점에서 성체 파리는 폐기해도 좋습니다. 이제 전기생리학 장비 설정을 진행할 준비가 되었습니다. 해부 현미경의 접안렌즈를 히트싱크가 장착된 청색 LED 광원에 부착하십시오.

포스트와 클램프를 사용하여 마그네틱 베이스를 접안렌즈와 LED 광원에 부착합니다. 마그네틱 베이스를 전기생리학 장비의 에어 테이블 위에 배치합니다. 다음으로, 광원을 제어 회로에 연결하고, 제어 회로를 외부 전압원에 연결합니다.

우리는 AD Instruments 사의 PowerLab 전기생리학 데이터 수집 시스템에서 출력되는 전압을 사용합니다. 전압원에 연결한 후, 청색광을 활성화하기 위해 제어 회로에 1~5V 펄스를 가하며, 청색광 빔이 유충 해부 부위에 집중될 때까지 마그네틱 베이스와 광원을 조정합니다. 적절한 조정이 완료되면 유충 해부 단계로 넘어갈 준비가 된 것입니다.

해부를 시작하려면, agar가 깔린 접시 바닥에 0.1 mm 핀 6개를 꽂습니다. 먹이 배지에서 3주 된 star larvae를 꺼내어 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 식염수로 유충을 헹구어 유충에 붙어 있는 먹이를 제거합니다.

그 다음 유충을 뽑힌 핀 근처의 해부 접시에 놓고, 접시의 절반을 식염수로 채웁니다. 이제 유충의 등 쪽에 두 개의 은색 튜브가 보이는 방향으로 놓습니다. 이 은색 튜브들이 바로 기관입니다.

기관 튜브 사이의 꼬리 부분에 커다란 핀을 직접 꽂습니다. 유충을 눌러 고정시킨 뒤, 머리 부분에 두 번째 커다란 핀을 꽂습니다. 핀을 꽂을 때 몸통이 길이 방향으로 길게 펴지도록 하십시오.

가위를 사용하여 꼬리 근처에 작은 절개를 만듭니다. 몸통 길이를 따라 절개를 계속합니다. 이때 가위 끝을 들어 올려 복측 신경이나 체벽 근육이 잘리지 않도록 주의하십시오.

동물의 네 모서리에 핀 4개를 꽂습니다. 이제 중앙 부분을 엽니다. 동물을 필렛 형태로 펼치기 위해 핀을 해부 접시에 고정합니다.

또한 핀셋과 가위를 사용하여 고정하는 방법을 교육할 수 있도록 표본을 고정하십시오. 동물의 소화 기관, 기관 및 지방체를 제거하십시오. 표본을 식염수로 헹굽니다.

세척 후, 마이크로 가위를 사용하여 표본의 전두엽과 복측 신경절의 위치를 찾습니다. 전두엽 바로 뒤쪽의 복측 신경절을 조심스럽게 절개합니다. 해부가 완료되면 청색광 자극 및 근육 기록을 진행합니다.

근육 기록을 수행하려면 10~20 MΩ 저항의 전극을 뽑습니다. 전자 전극 추출기를 사용하여 추출된 전극을 3 M KCl로 채웁니다. 채워진 전극을 전극 홀더에 장착합니다.

이제 유충 표본을 장치 위의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 청색광을 조절하여 해부된 표본이 광선의 중심에 오도록 합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유충의 신체벽 마디에서 6번 근육(M6)을 식별하고, 전극을 M6에 조심스럽게 삽입한 후 근육의 급격한 과분극 현상을 관찰합니다.

휴지 막전위는 -30 mV에서 -70 mV 사이여야 합니다. 전극이 적절하게 삽입되면 제어 회로에 20 내지 100 ms의 전압 펄스를 가하십시오. 제어 회로에 공급되는 전압을 점진적으로 증가시키십시오.

근육 세포에서 흥분성 접합 전위(exci junction potentials)를 관찰하십시오. 다음은 짧은 광펄스에 의해 유도된 흥분성 접합 전위를 보여주는 대표적인 결과입니다. 여기서 제시된 흥분성 접합 전위의 진폭은 모두 활성화되는 것으로 알려진 두 개의 운동 뉴런에서 합산된 진폭입니다.

M six. 빛의 강도를 낮추거나 조사 시간을 짧게 하면, 단일 운동 뉴런에서 발생하는 더 작은 진폭의 흥분성 접합 후전위를 노출시킬 수 있습니다. 지금까지 우리는 개구리 신경근 접합부에서 채널 로드 absent 2 매개 자극을 통해 시냅스 전위를 유도하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 해부 과정 중 표본의 체벽이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 해부 직후에는 표본이 과하게 흥분될 수 있으나, 시간이 지나면 점차 진정되어 양호한 기록이 가능해진다는 점을 기억하십시오. 근육에 핀을 꽂을 때는 첫 번째 근육층 아래의 체벽까지 들어가지 않도록 주의하시기 바랍니다.

전극이 체벽에 박혀 있을 때, 때때로 과분극 전위를 얻을 수 있지만 실제로 근육 세포 내에 진입한 상태는 아닐 수 있습니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.