Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 절차는 먼저 morpho와 시험관 내 전사(in vitro transcribed)된 cap mRNA를 준비하는 것으로 시작합니다. 마이크로 피펫에 morpho 함유 용액을 사이펀 방식으로 채운 후, 마이크로미터-정밀 1-셀 스테이지를 사용하여 주입량을 보정합니다. 그런 다음 제브라피시 배아를 수집하여 난황 미세 주입을 위해 미세 주입 챔버에 배치합니다.

작동 용액을 세포 바로 아래의 난황에 주입하고, 세포 미세 주입을 위해 세포질의 움직임을 이용하여 용액을 이동시킵니다. 주입 후 용액을 세포 세포질로 주입하십시오. 배아를 E3 배지에서 28.5 °C로 배양하고, 이후 단계에서 관심 있는 표현형이 나타나는지 확인하십시오.

안녕하세요, 저는 Yale University School of Medicine 유전학과의 Sasha 박사님 연구실 소속이자 아들인 Shiloh Yuen입니다. 오늘은 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 morpho 올리고뉴클레오타이드 유전자 넉다운 연구를 수행하기 위한 강력한 미세주입 기술을 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 낭성 신장 질환에서 섬모의 역할을 연구하기 위해 이 절차를 활용하고 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 유전자 기능 연구를 위한 하나의 강력한 접근법은 시험관 내에서 전사된 캡핑된 RNA를 제브라피쉬 배아에 미세 주입하는 것입니다. 본 시연에서는 EGFP 태그가 붙은 전사체를 미세 주입하고, 성공적인 주입의 가시적 판독값으로 살아있는 전체 배아의 GFP 발현을 이용하겠습니다.

먼저, 관심 있는 전사체에 대해 인 비트로(in vitro) 캡 RNA 전사 반응을 수행합니다. 본 실험실에서는 일반적으로 관심 있는 cDNA를 pCS2+ 벡터에 삽입하고, Mmessage mMachine SP6 키트를 사용하여 다량의 캡핑된 RNA 인 비트로 합성 반응을 수행합니다. 그다음, RNeasy Mini 키트를 사용하거나 페놀-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전법을 통해 RNA 샘플을 정제합니다.

RNA 준비물의 농도를 주의 깊게 측정하고, 주입 당일 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. RNA 샘플을 해동한 후 가볍게 볼텍싱하고 잠시 원심 분리하십시오. 이제 멸균수와 최종 농도 0.025~0.05% phenol red를 사용하여 작업 용액을 준비하십시오. phenol red는 배아 내로 용액이 주입되었음을 확인하는 가시적 마커 역할을 합니다.

여기서는 0.05% phenol red가 포함된 100 ng/µL 농도의 EGFP mRNA 작동 용액을 준비하겠습니다. 마지막으로, 작동 샘플은 얼음 위에 보관하고 RNA 스톡은 -80 °C로 되돌려 놓으십시오. 이 샘플을 주입할 준비가 되면 morpho 준비 단계로 진행하십시오.

Morpholino 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 단백질의 번역을 차단하거나 pre-mRNA 스플라이싱을 수정하여 유전자 발현을 조절하는 데 널리 사용됩니다. 제브라피쉬의 morphino는 유전자 기능을 넉다운(knock down)함으로써 강력한 역유전학 도구로 활용됩니다. 본 실험에서는 pkd2의 번역 개시 부위를 표적으로 하는 morph oligo를 미세 주입하겠습니다. 당사는 일반적으로 Gene Tools LLC에서 구입한, 관심 유전자에 맞게 특수 설계된 300 µM 농도의 morph oligo를 사용합니다.

그 다음 멸균수 100 µL를 첨가하여 3 mM 스톡 용액을 제조한 후, 용액을 소분하여 주사 당일 사용 전까지 -20 °C에서 보관합니다. 모리노(morino) 용액을 65 °C에서 5분 동안 가열합니다. 그 후 즉시 얼음 위에서 급냉(snap cool)하고 짧게 원심 분리합니다. 이 단계는 올리고의 2차 구조를 변성시켜 용액이 완전히 가용화되도록 합니다.

다음으로, Morpho 용액을 멸균수에 희석하고 최종 농도를 0.025~0.05% phenol red로 맞추어 작업 용액을 준비합니다. 본 시연에서는 0.05% phenol red가 포함된 0.5 millimolar PKD2-Morpho 작업 용액을 준비하겠습니다. 작업 용액은 실온에서 보관하고, 샘플을 주입할 준비가 되면 마이크로 피펫 충전 단계를 진행하십시오.

우선, 주입에 사용할 마이크로 피펫을 제작해야 합니다. 이는 마이크로 피펫 폴러 장치에서 BOS 실리케이트 유리 모세관을 가열하고 당겨서 수행합니다. 바늘이 제작되면, 소량의 점토나 접착 테이프 위에 올려둔 페트리 접시에 보관합니다.

다음으로, 쐐기 모양의 홈이 성형된 3개의 XE medium 플레이트에 1.5% agarose를 부어 미세주입 챔버 플레이트를 준비합니다. 이는 주입 과정 동안 배아를 쉽게 고정하는 방법으로 활용됩니다. 그 후 agarose 챔버 플레이트를 응고시킨 다음, 사용 전까지 4°C에서 보관합니다.

마이크로 피펫 충전을 시작합니다. 해부 현미경 50배 배율에서 겨우 보일 정도의 개구부가 생기도록 핀셋이나 수술용 면도날로 원위부 팁을 절단하십시오. 다음으로 작업 용액 2 µL를 취합니다.

커버 슬립 위에 한 방울을 떨어뜨린 후, 마이크로 파이펫의 뒷부분을 하이포더믹 바늘에 튜브가 연결된 5 mL 주사기에 부착하고, 마이크로 파이펫의 원위단 팁을 작업 용액 방울에 살짝 담급니다. 이때 마이크로 파이펫의 팁이 부러지지 않도록 주의하십시오. 주사기의 플런저를 당겨 마이크로 파이펫의 원위단을 통해 작업 용액을 사이펀 방식으로 흡입합니다.

다음으로, 마이크로 파이펫의 주입량을 보정하겠습니다. 마이크로미터 슬라이드 위에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨리고, 압력 펄스 마이크로 인젝터 장치의 전원과 공기 공급 장치를 켭니다. 그 다음, 마이크로 인젝터 장치의 마이크로 파이펫 홀더에 마이크로 파이펫을 장착합니다.

마이크로 인젝터는 압력 조절 방식이며, 해부 현미경 아래의 풋 페달을 눌러 배출을 활성화합니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 작동 용액 한 방울을 마이크로미터 오일 위에 떨어뜨려 주입량을 테스트하십시오. 오일 위에 구 형태로 떠 있는 방울의 직경을 측정합니다.

주입량(volume of injection)을 정밀하게 보정하기 위해 주입 시간과 압력을 조정하십시오. 이 단계는 미세 주입 실험의 재현성을 높이는 데 도움이 됩니다. 본 시연에서는 모든 미세 주입을 0.15 millimeters의 액적 직경으로 수행합니다.

마지막으로, 주입량이 보정되면 마이크로 인젝터의 hold 노브를 사용하여 마이크로 피펫의 역류와 누출을 방지하십시오. 이제 제브라피쉬 배아를 준비할 차례입니다. 제브라피쉬는 무작위로 교배하므로, 매일 아침 처음 몇 시간 동안 준비를 시작하여 1세포기 배아를 수집하고 이를 one XE three 배지에 넣으십시오.

3 mL 전이 피펫을 사용하여 미세주입 챔버 플레이트의 쐐기 모양 홈을 따라 배아를 배치합니다. 배아가 얕게 잠기고 완전히 잠기지 않도록 배지를 제거합니다. 이 단계는 배아가 홈 바닥에 안착하도록 돕고, 미세 피펫이 난막을 더 잘 관통할 수 있게 합니다.

이제 주입을 시작하겠습니다. 먼저, 해부 현미경 하에서 1세포기 배아의 세포질이 보이도록 마이크로 피펫으로 배아를 조작합니다. 마이크로 피펫의 팁이 부러지지 않도록 주의하며, 마이크로 피펫으로 난막과 난황을 차례로 관통하여 배아 내부로 주입합니다.

본 시연에서는 먼저 세포 바로 아래의 난황에 미세 주입을 수행하여, 세포질 흐름과 확산을 통해 작업 용액이 세포 내로 유입되도록 하겠습니다. 작업 용액에 첨가된 페놀 레드(phenol red) 덕분에 이러한 흐름을 시각적으로 확인할 수 있습니다. 이는 단세포 배아이므로, 핸드 프리(freehand) 방식이나 마니퓰레이터를 사용하여 주입할 수 있습니다.

세포질로의 직접 주입 방법 또한 시연하겠습니다. 세포 내로 직접 미세주입하는 방식은 더 확실하지만, 적절한 배아 방향 설정과 미세주입 기술이 필요하므로 시간이 더 많이 소요됩니다. 세포막은 난황막보다 더 견고하기 때문에, 미세 피펫을 난황을 통해 삽입하여 세포에 도달하는 것이 더 빠른 경우가 많습니다.

동물극이 홈의 바닥을 향하도록 세포질을 배치하고 안정된 손길로 작업하면 이 주입 방법을 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미세주입 후, 배아를 E three 배지가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 정상적인 발달을 위해 28.5 °C에서 배양하십시오. 이후 수 시간 및 수일 동안 배아가 발달하는 과정을 관찰하며 관심 있는 표현형이 나타나는지 확인하십시오.

미세주입의 성공 여부를 확인하기 위해, shield stage부터 in vivo 전체 배아 형광 현미경을 통해 발달 중인 배아 내 GFP 발현을 모니터링합니다. 구성체의 발현은 배아 발달 초기 단계에서 가장 강하게 나타나며, 주입된 capped RNA가 점차 분해됨에 따라 그리고 발현된 단백질의 안정성에 따라 발달 과정 중에 감소하는 경우가 많습니다. 이전에 발표된 결과에 근거하여, PKD2 morphant는 PKD2 돌연변이 제브라피쉬에서 발견되는 배면 체축의 만곡을 모방하고 수정 후 약 2~3일 사이에 신장 낭종을 나타낼 것으로 예상됩니다.

지금까지 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 morpho oligonucleotide 유전자 넉다운 연구를 수행하기 위한 견고한 미세주입 기술을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 가장 중요한 점은 흔들림 없는 손으로 안정적으로 주입하는 것임을 기억하시기 바랍니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.