모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

이 절차의 전반적인 목표는 성체 제브라피시 뇌의 뇌실에 모프 올리고뉴클레오티드를 미세 주입하고 방사선 신경교세포에서 유전자의 활동을 중단하는 것입니다. 이것은 먼저 얼룩말 물고기를 마취함으로써 이루어집니다. 다음으로, 두개골에 슬릿이 생성되어 가시가 있는 움푹 들어간 바늘을 사용하여 시신경 턱을 오버레이합니다.

그런 다음 모르포 용액을 절개 부위를 통해 대뇌실액으로 주입합니다. 마지막으로, 주입 효율과 정확도는 형광 현미경에서 확인됩니다. 궁극적으로, 성체 제브라피시 뇌의 방사상 신경교세포(radial glial cell)에 있는 관심 유전자로부터 조직 절편 및 면역조직화학 염색으로 분석할 수 있는 모르포 매개 유전자 녹다운(morpho mediated gene knockdown)을 통해 단백질 생산의 너무 효율적이고 광범위한 차단을 얻을 수 있습니다.

형질전환 접근법 또는 전기 작동 기반 전달 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 CVMI가 시간이 덜 걸리고 전체 전파 신경교세포 집단을 표적으로 하는 데 더 효율적이라는 것입니다. 조정 가능하고 많은 유전자를 동시에 무너뜨릴 수 있습니다. 주입 혼합물을 준비하려면 먼저 500 Micromolar Morpho 원액을 만듭니다.

10회 주입용 PBS를 사용하여 9마이크로리터의 희석 또는 희석되지 않은 모르포 용액을 1마이크로리터의 형광 추적 염료와 결합하여 10마이크로리터의 주입 혼합물을 준비합니다. 실온에 보관하십시오. 니들 풀러를 사용하여 다음 매개 변수에 따라 유리 주입 모세관을 준비하십시오.

압력 소스를 켜고 압력 설정을 50PSI 또는 3.5bar로 조정합니다. 다음과 같이 마이크로 인젝터 설정을 조정합니다. 유지 압력: 20PSI, 배출 압력: 10PSI, 주기 값: 2.5 및 100밀리초.

게이팅의 범위. 링 조명기를 켜고 현미경 무대 위에 링을 놓습니다. 모세관 홀더를 현미경 옆의 적절한 위치에 놓습니다.

유리 모세관을 홀더에 삽입하고 주입 각도를 45도로 조정합니다. 끝 집게 찾기를 사용하여 유리 모세관의 끝을 스냅하고 오리피스에서 출력되는 압력을 보정합니다. 바늘 끝을 물고기 물에 담그고 지속적인 압력 펄스를 가하면 기포가 최적의 압력 또는 오리피스 크기를 나타내는 단일 행을 형성해야 합니다.

유리 모세관에 주입 용액을 로드합니다. 기포를 피하려면 압력을 가하여 유리 모세관 끝과 적재된 주입 용액 사이의 공기를 제거합니다. 마취제 meab의 0.1% 줄기 용액을 준비한 후 원하는 수의 물고기를 물고기 물이 담긴 운송 용기에 옮깁니다.

200ml의 생선 물과 5ml의 MISP 원액을 혼합하여 작동하는 마취제를 준비합니다. 주사에 사용할 마취제를 페트리 접시에 반쯤 채웁니다. 물고기가 움직임을 멈출 때까지 마취제에서 물고기를 배양합니다.

그런 다음 그물을 사용하여 마취제의 페트리 접시로 옮깁니다. 절개를 용이하게 하려면 집게를 사용하여 물고기를 부드럽게 잡고 머리를 약간 아래쪽으로 기울인 상태로 방향을 잡습니다. 30 게이지 미늘이 있는 바늘 끝을 사용하여 뇌 조직에 손상을 줄 수 있으므로 너무 깊이 침투하지 않고 두개골에 작은 구멍을 만드십시오.

물고기를 계속 잡고 있으면서 절개 부위를 통해 유리 모세관 끝을 약 50mm 정도 삽입하고 뇌 조직과의 접촉을 피하면서 두부 쪽으로 향하게 합니다. 용액을 주입하면 즉시 분산되어야 합니다. 물고기를 민물고기 물에 옮기고 회복되도록 합니다.

약 30분 후 물고기를 다시 마취하고 형광 현미경으로 액체가 널리 분포되어 있는지 확인합니다. 적색 형광을 기반으로 합니다. 물고기를 수조로 되돌려 놓고 다시 순환시킵니다.

여기에서 볼 수 있듯이 행동 분석 또는 조직 표본 준비에 사용하기 전까지는, 정확한 주입은 주입된 용액을 뇌 전체로 분산시키고 심실 표면에 가까운 세포를 효율적으로 표적으로 삼습니다. 그러나 유리 모세혈관이 관통하는 주사에서는 뇌 조직이 주사 지점에서 짙은 형광 신호를 보냅니다. 그리고 주입량이 충분하지 않으면 약한 형광 신호가 관찰됩니다.

이 그림은 vivo morphos가 심실 표면 내부의 몇 개의 세포 직경을 관통할 수 있으므로 대조군에 비해 심실 세포를 효율적으로 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. 모르포. PCNA에 대한 모르포의 주입은 심실 세포의 유전자 발현을 효율적으로 녹다운합니다. 이러한 면역형광 이미지에서 A-B-R-D-U 펄스 추적 실험 후 BRDU 및 QCD 면역 염색은 안티센스 모포스를 사용한 PCNA의 녹다운이 신생아 뉴런의 현저한 감소로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 CVMI가 내인성 유전자를 녹다운하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다.

따라서 개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 물고기 뇌의 성인 S의 재생기 신경 발생 반응과 관련된 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.