머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Teer 분석의 정말 독특한 점은 항원 특이적 T 세포를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다. Teer은 우리 분석법의 핵심적인 독특한 측면이며, 이는 우리가 수행하는 증폭 단계와 결합되어 있습니다.

보시는 바와 같이, T 세포를 분리한 다음 우리가 관심 있는 T 세포가 샘플 내에서 농축될 수 있는 환경에서 배양합니다. 그러면 특정 세포들만 선택적으로 표지하여 유세포 분석기로 시각화할 수 있습니다. 수십 년 동안 사용되어 온 CFSE나 증식 분석과 같은 기존의 분석법으로는 전체 T 세포 집단에서 일어나는 현상에 대한 전반적인 벌크 측정값만 얻을 수 있었습니다.

하지만 신체 내에는 수백만 개의 T 세포가 있으며, 이들은 매우 다양하고 광범위한 패턴을 인식합니다. 운이 좋다면 샘플 내 세포 중 200,000개에서 300,000개당 하나 정도가 찾고 있는 세포일 것입니다. 그렇기 때문에 이 분석법에서는 농축 단계를 수행하는 것입니다.

그런 다음 테스트 번호를 통해, 직접 염색을 수행하므로 전체 세포 수의 1% 미만인 집단도 배경 신호와 구분하여 실제로 시각화할 수 있습니다. 따라서 매우 작은 차이까지 확인할 수 있으며, 해당 혈액 샘플 내에서, 즉 관심 패턴을 인식하는 해당 개인의 T 세포 수를 상당히 정밀하게 측정할 수 있습니다. 하지만 여기서 끝이 아닙니다. tetramer를 사용하면 이러한 T cells를 라벨링할 수 있을 뿐만 아니라, 추가 분석을 위해 이들을 분리할 수도 있습니다.

그리고 사용하시는 teter는 실제로 이곳 BRI에서 제작하신 것이 맞습니까? 네. 저희는 클래스 2 teter를 성공적으로 제작한 국내의 극소수 실험실 중 하나입니다. 저희의 의도는 이 기술을 도입하고자 하는 모든 실험실에 이러한 시약을 원가에 제공하는 것입니다.

다른 실험실에서 이 분석법을 재현할 때 가장 어렵거나 까다로운 점은 무엇이라고 생각하십니까? 음, 생각해보니 두 가지가 있는데, 바로 T 세포의 배양입니다. 이것은 정말로 어느 정도의 숙련된 기술이 필요한 작업입니다.

여러분은 세포에 추가 영양분이 필요한지 또는 성장을 위한 추가 공간이 필요한지에 대해 거의 매일 결정을 내려야 합니다. 그리고 제가 생각하기에 초보 운영자에게 가장 어려운 두 번째 부분은 실제 데이터 분석입니다. 신호의 어느 부분이 정말 긍정적인 반응인지, 아니면 단순히 물리적 특성과 인력에 의한 것인지를 파악하는 과정입니다.

또한 모든 것에 어느 정도의 점착성이 있다는 사실은 다시 한번 많은 경험을 필요로 하는 부분이며, 특히 전반적인 반응이 다소 약하게 나타나는 상황에서 더욱 그러합니다. 이 분석법으로 생성한 정보가 현재 시점에서 환자들에게 어떤 잠재적 이점을 줄 수 있을까요? 모든 자가면역 질환 환자에게서 나타나는 첫 번째 특징 중 하나는 해당 질병에 특이적인 항체들의 집합체라고 할 수 있습니다.

면역학의 기본 원리에 따르면 항체 반응이 일어나는 곳에는 항상 T세포 반응이 먼저 일어납니다. 따라서 고위험군 개인을 관찰하여 항체 형성보다 앞서 발생하는 T세포 활성도의 급증을 확인할 수 있다면, 이는 해당 개인이 자가항체를 형성하게 될 새로운 위험 수준을 정의하는 데 도움이 될 것이며, 결과적으로 중재 치료의 기회를 제공할 수 있을 것입니다. 본 절차에서는 항원 특이적 CD4 양성 T세포를 정제 및 확장하고, teters 시약과 장비 및 2급 층류 생물안전 작업대(class two laminar flow biosafety cabinets)를 사용하여 이를 시각화합니다.

이곳이 실험 절차의 기본 작업 공간이 될 것입니다. PBMC 분리를 위한 50 milliliter 원추형 튜브, primary tube, 그리고 XPBS가 필요합니다. XPBS는 칼슘과 마그네슘이 없어야 하며, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 fol pack plus가 필요합니다. drummed pipette aid, CoStar 10 mil pipette, 그리고 원심분리기 내의 혈액 오염을 방지하는 데 사용되는 50 mil 인서트가 포함된 에어로졸 캐니스터를 준비하십시오.

GS six R 원심분리용 트랜스퍼 피펫, 파스퇴르 피펫, 8.3 g/L의 염화암모늄, 1.0 g/L의 탄산수소나트륨, 0.04 g/L의 DI sodium EDTA를 포함하는 용혈 버퍼, PBS 내의 0.2% 트라이판 블루 용액, hemo CYTOMETER, 15 mL 원뿔형 튜브, 2 mM EDTA와 5 g/L를 첨가한 PBS를 포함하는 러닝 버퍼.

Milin biotech에서 구매한 BSA max CD four isolation kit two, stem cell technologies에서 구매한 EP magnet block. 다른 자기 세포 농축 플랫폼도 동일한 효율로 사용할 수 있습니다. 5 mL 폴리프로필렌 튜브, T세포 배지 제조를 위해 25 mM HEPES가 첨가된 RPMI 1640, T세포 배지 보충용 혼합 인간 혈청, T세포 배지 보충용 pen strip, 500 mL 0.22 µm bottle top filter, in vitro 증식 배양을 위한 멸균 48-well plate, 37 °C CO2 인큐베이터, 관심 에피토프를 포함하는 합성 펩타이드의 20 mg/mL 용액.

항원 특이적 T 세포를 시각화하기 위해 펩타이드가 로딩된 2클래스 TEER용 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브를 사용하였습니다. 항원 특이적 T 세포의 코팅에는 anti-CD3, anti-CD4 및 anti-CD25 항체를 사용하였습니다. 절차를 시작하기 전 FACS Caliber 유세포 분석기 또는 그와 동등한 장비를 준비하십시오. 작업 공간에 모든 재료와 장비를 배치하십시오.

다음 시연에서는 다음 단계들을 다룹니다. PBMC 분리, CD4 양성 T 세포 분리, 인비트로(in vitro) 확장 배양, 그리고 TEM 또는 염색을 통한 T 세포 시각화입니다. 1단계: PBMC 분리.

혈액 샘플을 준비합니다. 혈액은 주사기나 혈액 채취관에 수집해야 하며, 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린을 1:50 비율로 첨가하여 항응고 처리합니다. 혈액 1mL당 약 100만 개의 PBMC가 얻어질 것으로 예상되며, 그 중 약 40%는 CD4 양성 T 세포일 것입니다.

혈액을 50 mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 튜브당 25 mL의 혈액을 넣습니다. 혈장 성분이 고르게 분포되도록 ALI 응고 전 혈액을 부드럽게 혼합합니다.

PBS를 추가하여 총 부피를 40 milliliters로 맞추고, 11 milliliters의 fial을 혈액 튜브에 삽입한 후 피펫 에이드를 피펫에서 조심스럽게 제거하여 하단에 배치합니다. fial의 내용물이 튜브 바닥으로 천천히 배출될 것입니다. 수위가 일정해지면 혈액 튜브에서 피펫을 천천히 제거하고, 혈액 튜브의 캡을 닫아 폐기한 후 에어로졸 캐니스터로 옮깁니다.

캐니스터를 단단히 닫고 브레이크 없이 900 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 종료 시 브레이크를 사용하면 제동력으로 인해 원심분리 후의 세포층이 흐트러질 수 있으므로 브레이크를 적용하지 않는 것이 매우 중요합니다. PBMC는 상단의 노란색 혈장과 하단의 투명한 층 사이에 뚜렷한 흰색 층을 형성해야 합니다.

전이 피펫을 사용하여 백혈구 층을 조심스럽게 걷어내어 새 튜브로 옮깁니다. PBMC와 함께 일부 혈장과 피브린이 흡입될 수 있으나, 적혈구 층이 흡입되지 않도록 주의하십시오. 일반적으로 이 단계에서 두 개의 혈액 튜브를 하나의 세포 튜브로 합칠 수 있습니다.

펠릿 크기를 키우기 위해, 총 부피가 15 milliliters가 되도록 PBS를 추가하고 low break 및 aerosol 캔니스터 설정으로 500 times G에서 15분 동안 원심분리합니다. 페이스트 피펫을 사용하여 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 액체를 흡입하여 제거합니다. 각 튜브에 용혈 버퍼를 5~6 milliliters 추가하고 가볍게 섞어 덩어리를 제거하여 처리합니다. 5분 이내로 인큐베이션합니다.

PBS를 추가하여 총 부피를 50 milliliters로 맞추고 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 저속 브레이크 설정 시, 이러한 저속 회전 단계에서는 더 이상 에어로졸 캔니스터가 필요하지 않습니다. PBS로 채운 튜브를 사용하여 파스퇴르 피펫으로 액체를 흡입하여 두 번 세척하고, 최종 세척 단계 전 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 재부유된 세포의 일부를 취해 트라이판 블루로 희석한 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

이 세포 수는 T 세포 분리에 사용될 시약 부피를 결정합니다. 두 번째 단계인 CD4 양성 T 세포 분리에서는, 액체를 흡입하고 런닝 버퍼를 추가하여 10 million cells당 총 부피가 40 µL가 되도록 맞춥니다. 일반적으로 이는 30 µL의 버퍼와 잔류 펠릿 부피를 합쳐 조절합니다.

이 부피의 용액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. CD4 분리 키트의 항체 칵테일을 세포 10 million 개당 10 µL씩 튜브에 추가하고 10분 동안 얼음에 보관합니다. 튜브를 얼음에서 꺼내 캡을 열고, 세포 10 million 개당 30 µL의 러닝 버퍼를 추가합니다.

CD4 분리 키트의 자기 비드를 추가합니다. 세포 1,000만 개당 20 µL를 넣고 튜브 캡을 닫은 후 얼음 위에서 15분 동안 둡니다. 세척을 위해 런닝 버퍼를 10배 부피로 추가하고 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

원심 분리 중에 자석과 5 mL 폴리프로필렌 튜브를 작업 공간에 준비합니다. 세포 펠렛에서 액체를 흡입하여 제거합니다. 2 mL의 러닝 버퍼를 추가하고 트랜스퍼 피펫을 사용하여 덩어리를 제거합니다.

동일한 전이 피펫을 사용하여 세포를 5 mL 튜브로 옮기고 자석에서 15분 동안 배양합니다. 자석을 뒤집어 마지막 한 방울을 제외한 모든 액체를 비워냄으로써 CD4 양성 T세포 분획을 표시된 15 mL 튜브에 조심스럽게 따라냅니다. 5 mL 튜브에 러닝 버퍼 2 mL를 추가로 넣고 자석에서 제거합니다.

튜브 벽면에 붙은 CD4 음성 세포를 부드럽게 헹구어 표시된 15 mL 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 T 세포 배지 2 mL를 첨가합니다. 세포 수 측정을 위해 일부 분주액을 취한 후, 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

세포 분주액을 트라이판 블루로 희석하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이 세포 수 측정값에 따라 확장 배양에 사용할 웰의 수가 결정됩니다. 3단계입니다.

in vitro 확장을 위해, 세포 수를 기준으로 CD4 양성 및 CD4 음성 세포 펠릿에서 흡입액을 제거합니다. CD4 양성 세포에 배지를 추가하여 부피를 1mL당 300만 세포로 조정합니다. CD4 음성 세포에 배지를 추가하여 부피를 1mL당 1,000만 세포로 조정합니다.

확장 배양에는 웰당 300만 개의 CD4 음성 세포와 200만에서 300만 개의 CD4 양성 세포가 필요합니다. 일반적으로 CD4 양성 세포가 제한적인 세포군이 됩니다. CD4 음성 세포를 48웰 플레이트의 적절한 수의 웰에 분주하십시오.

각 웰에 300 µL를 추가한 후, 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 1시간 동안 보관합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어, 500 µL의 신선한 배지를 추가하고 전이 피펫을 사용하여 12~20회 부드럽게 파이펫팅한 후 모든 액체를 제거하여 웰을 세척합니다. 이 세척 과정을 통해 부착된 항원 제시 세포 층이 남게 됩니다.

세척이 완료되면 각 웰의 바닥을 적실 정도의 배지(약 100 µL)를 첨가합니다. 그렇지 않으면 부착 세포가 건조해질 수 있습니다. 필요한 경우, 각 웰에 200만에서 300만 개의 CD4 양성 세포를 첨가합니다.

각 웰의 총 부피가 1 mL가 되도록 배지를 추가합니다. 각 웰에 원하는 펩타이드를 첨가합니다. 자극을 위한 일반적인 농도는 10 µg/mL입니다.

마지막으로 플레이트를 37°C 인큐베이터에 7일 동안 배양합니다. 7일 후부터는 매일 각 웰에 50 µL의 hemo IL two를 첨가합니다.

현미경을 사용하여 세포 성장을 관찰하고, 아직 합류(confluent)되지 않은 웰은 배지의 절반을 제거한 후 신선한 배지와 50 µL의 IL-2를 첨가합니다. 합류된 웰은 세포를 재현탁하여 세포의 절반을 빈 웰로 옮긴 후, 신선한 배지와 50 µL의 IL-2를 첨가하여 분할(split)합니다. 세포를 배양기에 넣습니다. 확장된 세포는 배양 13~15일 후에 TEER 염색 준비가 완료됩니다.

4단계, 테트라머(tetramer) 염색을 통한 T세포 시각화 과정입니다. CD4 양성 T세포를 자극하는 데 사용된 펩타이드-MHC 조합에 맞는 테트라머를 구입하거나 조립하십시오. 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다.

각 웰에서 배지의 절반을 조심스럽게 뽑아냅니다. 각 웰에서 일반적으로 75 µL 또는 약 50,000 cells에 해당하는 세포 분량을 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 일반적으로 총 부피 50 µL당 1 µL의 tetramer를 추가하고 37 °C 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 음성 대조군으로서 각 웰의 두 번째 분량을 mismatch tetramer로 염색하는 것이 권장됩니다. 세포를 anti-CD3, anti-CD4 및 anti-CD25 항체로 라벨링합니다.

추가 또는 대체 항체 마커를 사용할 수 있습니다. 다만, 현재 이 채널은 teems를 위해 예약되어 있으므로 PE 표지 항체는 사용하지 마십시오. 또한, 모든 단일 색상 또는 이소타입 대조군은 추가 세포를 사용하여 표지하십시오.

항체 표지된 세포를 4°C에서 15~30분 동안 배양합니다. 각 튜브를 0.5~1 mL의 running buffer로 세척하고 230 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. FACS 튜브에서 액체를 조심스럽게 따라내고, 참조 비드, 단색 대조군 튜브, 아이소타입 대조군 등을 사용하여 유세포 분석기를 교정합니다.

유세포 분석기를 사용하여 각 튜브를 분석합니다. Tetra 양성 세포는 확장된 CD4 양성 T 세포들 사이에서 뚜렷한 군집으로 나타나야 합니다. Tetra 양성 세포는 보통 CD25 양성이며, 흔히 CD4 high 특성을 보입니다.