S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

이 절차는 SLAC 대조 균주는 일반 아미노산이 포함된 배지에서, 베이트(bait) 균주는 중동위원화된 라이신과 아르기닌이 포함된 배지에서 배양하는 것으로 시작합니다. 두 균주를 동일한 양으로 혼합한 후, 분쇄와 액체 질소를 이용해 용해시킵니다. 조추출물(Crude lysates)은 먼저 원심분리로 펠렛화한 후 spheros 비드에 결합시켜 불순물을 제거합니다. 그 다음 세포 용해물을 IgG 비드에 결합시킵니다.

IgG 비드에 결합된 단백질을 프로테아제로 처리하여 절단하고 침전시킵니다. 이제 샘플을 질량 분석법으로 분석할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시컬럼비아 대학교 생명과학연구소 세포환경생물학과의 Lone Lab 소속 Jesse Chao입니다.

오늘은 친화성 정제와 결합된 SILAC이라는 정량적 단백질체 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 단백질 복합체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 이 실험 절차에서 미끼 균주(bait strain)는 일반 아미노산을 포함하고 있으며, SILAC 대조 균주는 중이소토프 리신(lysine)과 아르기닌(arginine)을 포함하고 있습니다. 먼저, 미끼 균주와 대조 균주를 각각 1L씩 화면에 표시된 수치까지 별도로 배양하십시오. 다음으로, 배양액을 500mL Nalgene 원심분리 튜브에 붓습니다.

2,580 RCF에서 펠렛 세포의 부하를 균형 있게 맞춘 후 배지를 데칸트하고 펠렛을 재부유합니다. 세포를 50 mL 원심분리 튜브로 옮기면서 50 mL의 차가운 D H2O를 사용하고, 3,000 RCF에서 튜브를 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 이 시점에서 펠렛을 -80 °C에서 냉동 보관할 수 있습니다.

대조 균주 배양액과 미끼 균주 배양액의 비율을 건조 펠릿 무게 기준으로 1:1로 맞추는 것이 중요합니다. 각 세포 펠릿을 1:2000 비율의 protease inhibitor cocktail이 포함된 NP 40 buffer 10 milliliters에 재현탁하십시오. 한 튜브의 내용을 다른 튜브로 직접 부어 두 세포 배양액을 혼합하십시오.

세포 분쇄를 시작하려면, 먼저 미리 냉각시킨 막자사발에 액체 질소를 붓고 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 그다음, 세포 2 mL를 막자사발에 넣습니다. 액체 질소를 부어 세포를 동결시킵니다.

세포가 고운 분말 형태가 될 때까지 갈아줍니다. 모든 세포가 갈릴 때까지 이 과정을 반복하십시오. 이때 세포가 해동되지 않도록 주의하십시오.

필요시 액체 질소를 추가합니다. 다음으로, 분말을 얼음처럼 차가운 비커로 옮겨 실온에서 해동합니다. 가장자리가 녹기 시작하면, 해동된 후 1:200 비율의 PIC가 포함된 NP 40 버퍼 20 milliliters를 첨가합니다.

조 crude lysate를 40 milliliter Nalgene 튜브로 옮기고 Sovos SA 600 로터를 사용하여 16, 000 RPM에서 30분 동안 원심분리합니다. 대기하는 동안, SROs two B 비즈 300 microliters를 취해 300 microliters의 NP 40 버퍼로 비즈를 3회 세척합니다. 그 다음, 비즈를 300 microliters의 버퍼에 재현탁하여 1:1 슬러리 상태로 만듭니다.

다음 단계는 세포 용해물을 사전 제거(pre-clear)하는 것입니다. 이를 위해 먼저, 상층액을 새 튜브로 옮기고 Spheros two B 비드를 추가합니다. 냉장실의 회전 플랫폼에서 30분 동안 배양합니다.

인큐베이션하는 동안, IgG SROs bead 300 µL를 취하여 300 µL의 NP 40 buffer로 3회 세척합니다. 그 다음, bead를 300 µL의 buffer에 재현탁하여 1:1 슬러리 상태로 만듭니다. 인큐베이션이 끝나면, SROs를 원심분리하여 펠렛화합니다.

비드 두 개를 넣습니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 나중에 웨스턴 블로팅(western blotting)에 사용할 세포 용해물(cell lysate)의 일부를 따로 보관하는 것을 잊지 마십시오.

그런 다음 IgG 비드를 추가합니다. 더 효율적인 결합을 위해 내용물을 두 개의 튜브로 나누고, 저온실 내 회전 플랫폼에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 4 °C에서 크로마토그래피 컬럼에 비드를 수집합니다.

결합되지 않은 분획의 일부를 반드시 보관하십시오. 비드를 10 milliliters의 NP 40 buffer로 세척하십시오.

다음으로, 3 mL의 TEVC 버퍼로 비드를 세척합니다. 이때 비드의 일부 분취량을 따로 보관해야 함을 잊지 마십시오.

이는 비드를 용출시키기 위한 결합 효율을 반영하게 됩니다. 먼저, 1 mL의 TEVC 버퍼에 5 µL의 A-C-T-E-V를 추가합니다. 비드에 TEVC 버퍼를 추가하고 혼합합니다.

더 효율적인 혼합을 위해 내용물을 두 개의 1.5 milliliter EINOR 튜브로 옮긴 후, 저온실의 회전 플랫폼에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 비드를 원심 분리하여 상층액을 새 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세척 후 0.5 milliliters의 TEVC 버퍼를 추가하여 비드를 세척합니다.

8개의 튜브 내용을 하나의 튜브에 합칩니다. 총 1.5 milliliters의 ELU 8이 확보되어야 합니다. 침전시키기 위해 TEV Elu 8의 일부를 분취하여 보관하십시오.

100% TCA를 사용하여 분주액의 농도를 25% TCA로 조정합니다. 이를 위해 1.5 mL LU 8을 750 µL씩 두 개의 튜브에 나누어 담습니다. 각 튜브에 100% TCA 250 µL를 첨가합니다.

용액이 우윳빛으로 변해야 합니다. 그다음, 이를 얼음 위에 30분 동안 둡니다. 배양 후에는 혼합물을 주기적으로 볼텍싱합니다.

저온실 내의 탁상 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 30분 동안 원심분리합니다. 0.05 N 염산이 포함된 얼음처럼 차가운 아세톤 500 µL로 한 번 세척합니다. 그런 다음 4 °C에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 500 µL의 얼음처럼 차가운 아세톤으로 한 번 세척하고 4 °C의 최대 속도에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 아세톤을 조심스럽게 제거하고 은 염색을 위해 펠렛을 건조시킵니다. 펠렛을 1× SDS 샘플 버퍼 50 µL에 다시 현탁합니다.

침전된 단백질을 질량 분석 기반 분석에 사용할 계획이라면, 에탄올을 사용하여 침전시키는 것이 권장됩니다. 이를 위해 먼저 20 micrograms의 glycogen을 첨가한 다음, 샘플을 100% ethanol로 5배 희석하고 pH 5.0의 2.5 molar 스톡 용액을 사용하여 50 millimolar sodium bicarbonate로 조정하십시오. 튜브를 뒤집어 용액을 혼합하십시오.

실온에서 2시간 동안 방치합니다. 마지막으로, 내용물을 두 개의 einor 튜브에 나누어 담습니다. 실온에서 12,000 GS로 10분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠렛화합니다.

정제 과정 중에 보관한 분주 시료에는 사전 제거 처리된 세포 용해물, 결합 분획, 비결합 분획 및 용출 분획이 포함되어야 합니다. 실험의 결합 및 용출 효율을 확인하기 위해 Anti-TAP 항체를 이용한 Western blotting 또는 은 염색법으로 위 분주 시료들의 단백질 함량을 분석할 것을 권장합니다. 이 은 염색 젤에서 정제된 SCS two tap과 그 상호작용 파트너들이 시각화되었으며, 이 Western blot에서 태그가 없는 대조군과 비교되었습니다.

SCS two tap 정제 과정 중 수집한 다양한 분획을 Anti-tap 항체를 이용한 Western blotting으로 분석하였습니다. TEV protease 절단에 의해 용출된 후 SCS two tap이 더 낮은 분자량에서 이동하였으며, 용출 후 IgG 비드에는 SCS two tap이 남아 있지 않음을 확인하였습니다. 이는 정제 효율이 매우 높았음을 입증합니다.

지금까지 IgG 비드를 이용한 친화성 정제를 통해 단백질 복합체를 정제하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 정제 과정을 시작하기 전에 건조 펠렛 무게를 기준으로 기본 균주와 대조 균주를 반드시 일치시켜야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. LAC는 단백질 결합 파트너에 대해 편향되지 않고 정량화된 측정값을 제공하므로, 시료 손실을 최소화하기 위해 탠덤 친화성 정제(TAP purification)의 첫 번째 단계만 수행합니다.

비특이적 결합이 상당량 발생하는 경우, Cold Spring Harbor 매뉴얼에서 확인할 수 있는 전체 프로토콜을 수행하시기 바랍니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

자, 어서요, Mark 씨. 아, 가세요.