의 단백질 단지의 식별

본 실험의 목적은 E. coli 유래 천연 MultiPro 복합체의 단백질, 단백질 상호작용 및 하위 단위 구성을 확인하는 것입니다. 이를 위해 SPA 태그와 선택 마커를 인코딩하는 서열 특이적 선형 PCR 생성물을 증폭하며, 이는 박테리아 Fage lambda 재조합 시스템을 이용하여 ddy 3, 3 0 배경의 carboxy 말단 융합 형태로 통합 및 발현됩니다. 두 번째 단계로, 저농도 단백질 복합체를 효율적으로 회수하기 위해 cow modlin 및 Anti-Flag 친화성 비즈를 사용하여 2단계 정제를 수행합니다. 다음으로, cow modlin, 용출 버퍼 또는 CEB로 용출된 결합 단백질을 trypsin으로 소화시킨 후 질량 분석법으로 처리하여 단백질을 식별합니다.

결과에 따르면, 전사 종결 및 항결정 인자를 포함한 핵심 RNA 중합효소 효소의 여러 하위 단위들이 태그가 부착된 RNA 중합효소 하위 단위 D 단백질과 효율적으로 공동 정제되었으며, 이는 이 접근 방식을 통해 새로 연관된 구성 성분들을 효율적으로 찾아낼 수 있음을 나타냅니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 2회 반복 친화성 정제 과정에서 어려움을 겪을 수 있는데, 대규모 배양액으로부터 저발현 및 고발현 복합체를 효율적으로 회수하기 위해서는 적절한 완충 용액을 사용하여 세포 용해물을 세심하게 처리하는 것이 절대적으로 필요합니다. 친화성 정제 및 질량 분석 절차는 본 실험실의 기술자인 Olga Kagan과 HBO guo가 시연할 예정입니다. 이 프로토콜은 서면 프로토콜에 기술된 바와 같이 Lambda red 재조합 기작이 발현되는 DDY three 30 균주에 특정 증폭 서열을 표적화하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 박테리오파지 Lambda 재조합 시스템 발현 균주를 2 mL의 Luria bati 또는 LB 배지에서 32 °C, 180 RPM으로 흔들어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 500 mL 삼각 플라스크에 담긴 70 mL의 신선한 LB 배지에 접종합니다. 접종물을 32 °C에서 180 RPM으로 흔들어 OD 600이 약 0.8에 도달할 때까지 배양합니다. 플라스크를 42 °C 항온 수조에서 180 RPM으로 부드럽게 흔들며 15분 동안 배양하여 세포를 유도합니다.

유도 직후, 플라스크를 얼음물 슬러리 배스에 넣고 흔들어 주며 최소 30분 동안 배양합니다. 서면 절차에 기술된 대로 세포를 수확하고 세척한 후, 세포 펠렛을 700 µL의 차가운 멸균수에 다시 현탁하여 전기천공법을 통한 전기 천능 세포를 준비합니다. 정제된 앰플리콘 1 µL를 전기 천능 세포 40 µL에 도입합니다.

상동 재조합 및 통합 후 세포를 전기 천공합니다. 태그/카세트가 염색체로 성공적으로 재조합된 형질전환체는 카나마이신(canamycin) 내성을 기준으로 선택합니다. SPA 태그의 Flag 에피토프에 선택적인 Anti-Flag M2 항체를 사용하여 SPA 태그 융합 단백질이 정확하게 생성되었는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅용 형질전환체를 여러 개 선택합니다. 4L 플라스크에 25 µg/mL의 카나마이신이 첨가된 신선한 TB 배지 990 mL를 넣고, 여기에 하룻밤 동안 배양한 배양액 10 mL를 옮깁니다.

OD 600 값이 2에서 3 사이가 될 때까지 32 °C에서 250 RPM으로 일정하게 흔들어 5~6시간 동안 배양합니다. 1 L의 E. coli SPA tag 배양액을 깨끗한 원심분리 병으로 옮기고 4 °C에서 3,993 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 그 후 서면 프로토콜에 기술된 대로 세포를 재현탁합니다.

샘플을 초음파 처리를 위해 얼음 위에 놓인 멸균 스테인리스 스틸 컵으로 옮깁니다. 프로브를 샘플에 담그고 3분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 초음파 처리된 용해물을 원심 분리하여 과열된 샘플이 식을 때까지 2분 더 기다립니다.

원심분리 튜브의 S 상층액을 50 mL 폴리프로필렌 팰콘 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 액체 질소를 사용하여 샘플을 급속 냉동하고, 초음파 처리된 냉동 세포 추출물을 향후 사용을 위해 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 냉동된 초음파 처리 세포 추출물의 친화성 정제를 시작하려면 튜브를 냉수에 넣고, TH 세포 추출물을 3 µL의 benzo(뉴클레아제)와 함께 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.

이 혼합물에 비이온성 계면활성제 Triton X 100과 200 µL의 Anti-Flag M2 agro beads 현탁액을 첨가합니다. 튜브를 4 °C에서 3시간 동안 회전시켜 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 3시간의 회전 후, 튜브를 1,700 ×g에서 6분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 느슨한 침전물이 흐트러지지 않도록 주의하며 상청액을 최대한 제거합니다.

남은 SNA에 펠렛을 재현탁한 후 폴리프로필렌 정제 컬럼으로 옮깁니다. 용출액이 중력으로 배출될 수 있도록 컬럼 바닥의 배출 플러그를 제거합니다. 다음으로, 1배 농도의 FC 버퍼 200 µL로 컬럼을 5회 세척하고, 서면 프로토콜에 설명된 대로 TEV를 이용한 절단(cleavage) 단계를 진행합니다.

칼럼의 상단과 하단을 모두 단단히 밀봉하여 빠르게 절단합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 회전시켜 칼럼 내부의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 상단 캡과 하단 플러그를 제거하여 용출액을 새 칼럼으로 옮깁니다.

기존 컬럼을 400 µL의 1x Cal Modlin 결합 버퍼와 150 µL의 Cal Modlin 결합 비드 현탁액으로 세척합니다. 1x Cal Modlin 용출 버퍼를 사용하여 결합된 단백질을 새로운 eend orph 튜브에 50 µL씩 4개 분획으로 용출합니다.

용출 분획물을 깨끗한 eend orph 튜브 두 개에 동일한 부피로 나누어 분배합니다. 그런 다음 speed vacuum을 사용하여 두 튜브의 내용물을 건조시킵니다. 한쪽 튜브의 건조된 용출물은 본문에 기술된 대로 은 염색 겔 전기영동에 사용하고, 다른 하나는 -80°C에 보관합니다.

나중에 질량 분석법에 사용하기 위해, 건조된 시료에 소화 버퍼(digestion buffer) 50 µL와 100 mM tris phosphine hydrochloric acid 0.9 µL를 첨가합니다. 환원 단계를 위해 혼합물을 상온에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, 500 mM IDO acetamide 1 µL를 첨가하고 시료 알킬화를 위해 암실에서 40분 동안 더 배양합니다. 두 번째 배양이 끝난 후, 혼합물에 trypsin 1 µg을 첨가합니다. 배양 후, 시료를 37 °C에서 5시간 동안 또는 상온에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1 µL의 아세트산을 첨가하여 반응을 반드시 정지시키십시오. 그 다음, 펩타이드가 팁 파이프 펩에 효율적으로 결합될 수 있도록 본문에 설명된 대로 Millipore zip tip과 피펫 팁을 준비하십시오. 펩타이드 혼합물을 20회 혼합한 후, 세척액을 흡입하고 분사하여 팁에 결합되지 않은 펩타이드 혼합물을 씻어내십시오.

펩타이드 혼합물이 팁에 효율적으로 결합할 수 있도록 이 과정을 두 번 반복하여 펩타이드가 결합된 팁을 준비합니다. 습윤 및 평형화 용액 10 µL를 흡입하여 깨끗한 엔도르프 튜브(endorph tube)에 분주합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

속도 진공 농축기로 용출된 시료를 건조시킨 후, 질량 분석기로 즉시 분석하거나 사용 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 이 절차에 사용된 마이크로 컬럼은 약 10 cm의 3 µm lunar C 18 수지로 충전되어 있으며, orbitrap 장비와 직렬로 연결된 pro Zion 나노 일렉트로스프레이 이온원과 인터페이스됩니다. 펩타이드 분리 동안 약 300 nL/min의 안정적인 팁 유속을 유지하여 펩타이드 희석을 달성하기 위해 pro Zion 나노 흐름 바이너리 HPLC 펌프를 사용하며, 시료의 복잡성에 따라 유기 완충액 기울기를 설정합니다.

이 e coli SPA 샘플의 경우, 이동상 용매 A는 0.1% formic acid가 포함된 95% HPLC grade water와 5% acetonitrile이며, 용매 B는 0.1% formic acid가 포함된 5% HPLC grade water와 95% acetonitrile을 사용합니다. 질량 분석 후, SeaQuest와 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용하여 e coli 단백질 서열 데이터베이스를 대상으로 스펙트럼을 검색합니다. 낮은 허위 발견율(false discovery rate)을 보장하기 위해 StarQuest와 같은 확률 알고리즘을 사용하여 결과를 통계적으로 필터링합니다. SPA 태그가 붙은 RNA polymerase sigma factor와 기능 미상의 단백질 yak LA 모두 alpha, beta, beta prime 서브유닛을 포함하는 core RNA polymerase 효소 및 RNA polymerase recycling factor와 특이적으로 공동 정제되었습니다. 태그된 RNA polymerase sigma factor와 달리, yak L은 필수 전사 종결 anti-termination factor에 추가로 결합하여 전사 과정에서의 특수한 기능을 수행함을 시사합니다.

LCMS를 통해 젤에서는 확인되지 않았던 RNA polymerase Omega subunit과 전사 종결 및 결정 인자, USA 및 NUSD를 포함하여 함께 정제된 여러 다른 소량의 단백질들이 추가로 검출되었습니다. 반대로, 태그된 황 동원 기구 S-U-F-B-S-U-F-C와 SUFD를 이용한 독립적인 실험에서는 이들이 서로 함께 정제되어, 단일 스캐폴딩 복합체로서 철-황 클러스터 생합성에 공동으로 참여함을 나타냈습니다. 이 대표적인 사례는 필수적인 생물학적 과정에 참여하며 이전에 충분히 연구되고 상세히 주석이 달린 박테리아 MultiPro 복합체들이 종종 효율적으로 식별 가능한 새로운 연관 성분들을 가지고 있다는 사실을 강조합니다.

이러한 접근 방식을 사용했을 때, SUFB 단백질의 낮은 복제 수로 인해 SUFC 및 SUFD 풀다운 실험에서 관찰된 강한 강도에 비해 신호 강도가 약하게 나타났을 수 있습니다. 안정적인 다단위 단백질 복합체의 조성을 정의하기 위해, 미끼-먹이(bait-prey), 미끼-미끼(bait-bait) 및 먹이-먹이(prey-prey) 관계의 고유성을 고려하여 신뢰도가 높은 상호작용에 공동 정제 점수를 부여하였습니다. 그런 다음 마르코프 클러스터링(markoff clustering) 알고리즘과 같은 그래프 클러스터링 절차를 사용하였습니다. 이를 통해 분할된 확률적 PPI 네트워크에서 개별 단백질 클러스터가 식별됩니다.

추정 상호작용 네트워크는 Cytoscape를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 프로테오믹스 데이터와 게놈 분석법으로 추론된 추가적인 기능적 연관 증거를 결합하면, 기존에 주석이 달린 E. coli 단백질의 새로운 기전적 역할을 조사하는 데 활용할 수 있습니다. 본 연구에서는 E. coli에서 더 넓은 기능적 이웃으로 참여하는 단백질 복합체 및 기능적 모듈의 서브네트워크를 정의하였습니다.

메인 계층적 클러스터 그레이엄(Graham)은 e coli의 기능적 고아 유전자 및 특성화된 유전자에 대한 기능 예측 패턴과 기존 주석을 보여주며, 노란색과 파란색은 각각 기존 기능과 추론된 기능을 나타내고 색상의 강도는 신뢰도 점수를 반영합니다. 다양한 이웃(neighborhood)과 관련된 생물학적 과정은 오른쪽에 표시되며, 삽입도는 통합된 물리적 및 기능적 상호작용 네트워크 유사성 점수를 기반으로 한 대표적 이웃의 개별 구성 요소를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 친화성 정제 및 질량 분석 결합법을 사용하여 e coli의 안정적인 단백질 복합체를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

원칙적으로, 이 기술은 재조합이 가능한 모든 다른 종의 막 단백질 복합체 또는 단백질 복합체의 특성을 분석하는 데 적용될 수 있습니다.