gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

본 비디오 프로토콜에서는 폐 조직 해리 후 GentleMACS를 사용하여 성체 마우스 폐 조직을 분리하는 방법을 보여드립니다. Collagenase D 및 DNase I 존재 하에 단일 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너로 여과하고 원심 분리하여 향후 응용 단계에서 사용할 수 있도록 현탁합니다. 안녕하세요, 독일 Miltenyi Biotec의 Melanie Mlu입니다.

오늘은 GenX dissociation을 사용하여 마우스 폐 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 재현 가능하고 자동화된 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 백혈구 또는 내피 세포 준비를 위한 단일 세포 현탁액을 제조할 때 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

프로토콜을 시작하기 전에 몇 가지 표준 용액을 준비하여 대기시켜야 합니다. 우선, Hebes 완충액이 필요합니다. 다음으로, 100 mg/mL의 효소와 Hebes 완충액을 포함하는 collagenase D 용액을 준비합니다.

셋째, mL당 20,000 unit의 dase one을 포함하는 dase one 용액입니다. 마지막으로, 두 가지 일반적인 완충 용액이 있습니다. pH 7.2의 전형적인 PBS 완충액과 AutoMax 세척액 및 BSA 스톡 용액으로 제조한 PEB 완충액입니다.

6~7주령의 암컷 생검 마우스에서 적출한 폐를 사용하여 프로토콜을 시작합니다. 폐에 심장, 흉선과 같은 인접 장기, 수출혈관 및 수입혈관, 기관 및 결합 조직이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 적혈구를 제거하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에서 조직을 헹굽니다.

일반적으로 이 연령대 마우스의 폐 무게는 110에서 150 mg 사이입니다. 더 고령의 동물이나 다른 마우스 계통의 폐를 분리할 계획이라면, 조직과 완충액의 무게를 측정하십시오. 튜브 하나당 최대 450 mg의 조직을 분리할 수 있습니다.

폐 조직을 4.9 mL의 heis buffer가 채워진 gentle max C tube로 옮깁니다. 폐 조직과 buffer에 collagenase D 용액 100 µL를 첨가하여 최종 농도가 2 mg/mL가 되도록 합니다. 이제 dase 10 µL를 추가합니다.

150 mg 이상의 조직에 사용할 용액입니다. dase one 용액 20 µL를 추가하십시오. C 튜브가 단단히 닫혔는지 확인한 후, gentle max dis 위에 거꾸로 놓으십시오.

조직이 로터와 스테이터 사이에 위치해 있는지 확인하십시오. 폐(lung) 프로그램을 선택하고 시작 버튼을 눌러 실행한 뒤, 프로그램이 종료되면 정지시키십시오. 기기에서 C 튜브를 꺼내어 샘플을 30분 동안 배양하십시오.

37 °C 인큐베이터에서 배양하는 동안, max mix 튜브 로테이터를 사용하여 튜브를 회전시키거나 5분마다 수동으로 돌려주어야 합니다. 배양이 끝나면 C 튜브를 다시 gentle max Associator로 옮기고 두 번째 폐 프로그램을 실행하십시오. 프로그램이 실행되는 동안, 캡을 70 µm 메쉬 셀 스트레이너로 교체하여 여과된 세포를 수집할 50 mL 튜브를 준비하십시오. 해리 프로그램이 종료되면, 튜브 내 샘플 물질의 분포 상태에 따라 샘플 물질을 농축하기 위해 튜브를 짧게 원심 분리할 수 있습니다.

분리된 세포는 C 튜브의 격막 밀봉 캡을 통해 피펫팅하여 제거할 수 있습니다. 적절한 1000 microliter 피펫 팁을 사용하여, 세포 현탁액을 세포 스트레이너에 처리함으로써 더 큰 입자나 응집물을 제거합니다. 용액이 모두 빠져나가면, 여과된 세포를 펠렛화하기 위해 실온의 HBSS buffer 5 milliliters를 추가로 더해 세포 스트레이너를 세척합니다.

50 mL 튜브를 300 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포 펠렛을 원하는 부피의 상온 PEB 버퍼에 재현탁합니다.

상청액을 따라내지 마십시오. 이제 후속 응용 단계로 진행할 수 있습니다. 이 절차를 사용하여 마우스 폐 조직을 해리하면 높은 비율의 생존 가능한 백혈구와 내피세포를 얻을 수 있습니다.

유도된 단일 세포 현탁액을 CD 45 PE, CD 1 46 FITC 또는 CD 31 FITC로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였습니다. 이 도표는 CD 11 C 마이크로비드, minimax 분리기 및 두 개의 MS 컬럼을 사용하여 수지상 세포를 농축한 결과를 보여줍니다. 이제 gentle mix 해리법과 C tube를 사용하여 마우스 폐 조직으로부터 표준화된 방식으로 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드렸습니다.

이 방법은 효율적인 조직 해리를 가능하게 합니다. 이 절차를 수행할 때는 폐를 적절하게 절제하고 절제 직후에 조직을 처리하는 것이 중요합니다. 이렇게 준비된 단일 세포 현탁액은 이후 추가 실험에 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 세포의 자기 라벨링과 그 후의 백혈구 또는 내피세포 분리가 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.