Patterning의 Biomolecules에 대한 Microelectrodes에 자기 조립 Monolayers을 Antifouling

본 절차는 실리콘 기판 위에 미세 전극을 제작하는 것으로 시작합니다. 미세소관의 오염을 방지하기 위해 미세 전극과 기판 위에 폴리에틸렌 글리콜 자기 조립 단분자층을 형성합니다. 그 다음으로 루미닌 표지 미세소관을 준비합니다.

마지막으로, 전기영동을 이용하여 미세소관을 패턴화된 전극 위에 배열합니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 A&M 대학교 물리학과의 Nana Lab과 의생명공학과의 분자생체역학 실험실의 John Noel입니다. 저는 물리학과 소속이자 텍사스 A&M 대학교의 Center Skill Science and Technology 책임자인 Wil free Teza입니다.

저는 Texas A&M 대학교 의공학과 분자 생체역학 연구소의 소장인 Juan Quang입니다. 오늘은 비방오(non-fouling) 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer)이 코팅된 미세 전극을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구소에서는 전기영동을 이용한 미세관의 정렬을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 우선, 스크라이버나 웨이퍼 커터를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 기판으로 사용할 1 cm x 1.5 cm 크기로 자릅니다. 이제 기판이 충분히 잠길 만큼의 아세톤이 담긴 비커에 기판을 넣고, 기판이 마르지 않도록 주의하며 5분 동안 초음파 세척합니다.

신선한 아세톤으로 헹군 후, 즉시 이소프로판올로 다시 헹구고 질소를 사용하여 건조합니다. 표준 포지티브 톤 포토리소그래피 또는 전자빔 리소그래피를 사용하여 깨끗한 기판 위에 금 마이크로 전극을 제작합니다. 패턴 기하학적 구조를 설계할 때, 각 전극 패턴의 직경을 100 microns 미만으로 유지하십시오. 폴리에틸렌 글리콜 트리메톡시 실란 자기조립 단분자층 또는 peg Sam으로의 피복을 보장하기 위해, 패턴에서 300 to 500 micrometers 떨어진 위치에 접촉 패드를 배치하고 패드와 전극을 연결하는 1 millimeter 라인을 포함하십시오.

레지스트 층에 패턴을 형성한 후, 핀셋을 사용하여 컨택 패드부터 기판 가장자리까지 레지스트에 선을 긋습니다. 금속 증착 시, 이 긁힌 선을 통해 전극과 기판 가장자리 사이에 전기적 접촉이 가능해집니다. 금속 층을 증착하기 위해 가급적 두 개의 소스가 있는 증착 챔버를 사용합니다.

전극은 2 nm의 크롬을 증착한 후 6 nm의 금을 증착하여 형성합니다. 진공을 깨지 않은 상태에서, 챔버 내부에 설치된 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal micro balance)를 사용하여 증착 과정 중 박막의 두께를 측정할 수 있습니다. 이제 통풍이 잘 되는 곳에서 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer) 준비를 시작하며, 오븐을 75 °C로 예열합니다. 250 mL 유리 비커에 톨루엔 20 mL와 peg seline 1 mL를 첨가하여 기능화 용액을 준비합니다.

피펫으로 5~10회 상하로 섞은 후, 피펫으로 30초 동안 저어 잘 혼합합니다. 패턴 샘플의 패턴 면이 위로 향하게 하여 비커에 넣고, 샘플이 용액에 완전히 잠기고 비커 바닥에 고르게 배치되었는지 확인합니다. 비커를 오븐에 넣고 SAM이 형성되는 동안 18~21시간 동안 베이킹합니다.

22 by 50 millimeter 유리 커버 슬립 위에 1 nm의 크롬을 증착한 후 4 nm의 금을 증착하여 상대 전극을 준비합니다. 상대 전극은 연한 회색 또는 분홍색 색조를 띠며 거의 투명해야 합니다. 청결 상태를 유지하기 위해 상대 전극의 코팅면이 위로 향하도록 페트리 접시에 보관하십시오.

오븐에서 18~21시간이 지난 후, 비커를 오븐에서 꺼냅니다. 톨루엔이 증발하여 패턴 샘플이 점성이 있는 peg cline 잔여물 속에 남아 있어야 합니다. 비커에 톨루엔 20 milliliters를 넣고 샘플을 1~2분 동안 담가 둡니다.

비커에서 샘플을 꺼내 톨루엔으로 헹군 후, 이소프로판올로 헹구고 마지막으로 질소로 건조합니다. 이 단계에서 샘플은 깨끗해 보여야 하며, Sam 층은 육안으로 보이지 않아야 합니다. 이렇게 준비된 Sam은 서늘하고 건조한 조건에서 보관할 경우 최대 2일까지 사용할 수 있습니다.

SAM 형성이 제대로 되지 않으면 표면에 뿌옇거나 색상이 불균일한 잔여물이 코팅됩니다. SAM 준비가 완료되면, 이제 튜불린을 중합하여 미세소관을 형성할 수 있습니다. 먼저 표시되지 않은 튜불린과 r-domine 튜불린을 해동한 다음, 밝은 미세소관을 얻기 위해 표시되지 않은 튜불린과 표시된 튜불린을 2:1 비율로 즉시 혼합하십시오.

피펫으로 여러 번 흡입 및 배출하여 잘 섞어줍니다. 다음으로, 37 °C의 가열 수조에서 20분에서 40분 동안 tubulin을 중합시킵니다. 20 µM Taxol을 pipee 버퍼와 혼합하여 pipes Taxol 버퍼를 준비합니다.

피펫팅을 여러 번 반복하고 볼텍싱하여 잘 섞은 다음, 튜브를 37°C 가열 수조에 넣습니다. 중합이 완료되면, 따뜻한 Taxol 버퍼를 사용하여 미세소관을 희석하고 빛을 차단하여 보관합니다. 미세소관 중합이 성공적으로 이루어졌는지, 그리고 수 분간의 형광 여기 상태에서도 미세소관이 안정적인지 확인합니다.

튜불린의 미세소관 중합이 완료된 후, 산소 제거 혼합물과 함께 준비된 미세소관을 이미징합니다. 이제 전기영동을 이용해 MTS 패턴 형성을 시작하겠습니다. 우선, 유리 슬라이드 위에 양면테이프를 놓고 면도날을 사용하여 얇은 조각으로 자릅니다. 패턴화된 Sam 코팅 시료 위에 양면테이프 두 조각을 부착하되, 전극이 테이프 사이에 위치하고 연결 경로가 테이프와 수직이 되도록 배치합니다.

금속 면이 테이프에 닿도록 대전극을 양면 테이프 위에 배치하되, 샘플의 가장자리가 대전극보다 약 3 mm 정도 더 튀어나오게 합니다. 절연 구리 마그넷 와이어를 15 cm 길이로 여러 개 자르고 양 끝단의 절연체를 1 cm씩 벗겨냅니다. 은 페인트 소량을 사용하여 기판의 노출된 금 영역에 와이어를 부착하되, 대전극과 전기적으로 접촉되지 않도록 주의합니다.

이제 은 페인트를 사용하여 두 번째 와이어를 카운터 전극에 연결하십시오. 은 페인트로 연결한 전극 와이어는 테이프를 사용하여 샘플에 더 단단히 고정할 수 있습니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 원하는 희석 농도의 미세소관을 주입하고, 전압을 가하기 전에 20배 배율로 실리콘 웨이퍼 상의 패턴 위치를 확인하십시오.

플로우 챔버의 깊이 때문에, 플로우 챔버의 상단 표면을 이미지화하려면 긴 작동 거리(working distance) 렌즈가 필요할 수 있습니다. 샘플 표면에서 플로우 챔버 상단 표면까지의 거리는 테이프의 두께에 의해 결정되며, 약 60 내지 100 micrometers 정도여야 합니다. 최대 1 volt의 전압을 가하고 미세소관의 이동을 관찰하십시오.

미세소관의 가역적 포획을 원하는 경우, 측면 표류를 방지하기 위해 매니큐어를 사용하여 유동 챔버를 밀봉하고 약 0.5 volts까지의 낮은 전압을 사용하십시오. 전압을 약 0.9 내지 1.2 volts로 인가하면 미세소관이 전극 표면에 국소화되며, 이때 현미경의 수직 초점 평면을 조정하여 이동을 추적할 수 있습니다.

전압이 높을수록 이동 속도가 빨라지고 접착력이 강해지지만, 과도한 전압은 전기 분해를 유도하고 중합체 해리를 일으킵니다. 미세소관(Microtubules)의 경우, SAM 코팅이 미세 전극에 미세소관이 흡착되는 것을 방지하기 때문에 MT 패턴 형성을 위한 SAM 코팅 미세 전극 준비 방법을 설명해 드렸습니다. 이 절차는 미세소관의 가역적 패턴 형성에도 사용할 수 있습니다.

또한, 이 공정은 마이크로튜불(microtubules)에만 국한되지 않으며, 일반적으로 생체 분자를 패턴화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.