단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 흡착과 세포 성장을 제어하기 위한 2차원 패턴 기판을 개발하는 것입니다. 이는 포토리소그래피를 사용하여 패턴 마스터를 제작하고, 이를 통해 마이크로 접촉 인쇄용 A-P-D-M-S 스탬프를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 단백질을 흡착하는 영역과 저항하는 영역을 가진 패턴을 생성하기 위해 마이크로 접촉 인쇄 과정을 거쳐 패턴화된 금 기판을 준비합니다.

다음으로 단백질과 세포를 기판에 첨가하여 패턴을 시각화하고 연구합니다. 형광 및 위상차 현미경 관찰 결과, 이러한 패턴 기판 상에서 단백질과 세포가 효과적으로 국한되어 성장하고 거동하는 것으로 나타났습니다. 단백질의 MicroCon 프린팅과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 글리콜 말단 단분자층이 패턴 배경에서의 비특이적 단백질 및 세포 흡착을 방지한다는 점입니다.

일반적으로, 이 방법이 처음인 사람들은 인쇄되는 각 패턴에 맞게 적절한 스탬핑 기술을 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 패턴화된 마스터 센터 준비를 시작하려면, 스핀 코더 위의 실리콘 웨이퍼를 2주기 스핀 프로그램의 첫 번째 단계 동안 아세톤으로 헹굽니다. 스핀 프로그램의 두 번째 단계에서 아세톤이 증발하여 깨끗하고 건조한 웨이퍼 상태가 되면, 스핀 시작 시 웨이퍼에 포토레지스트를 도포한 후 앞서 설명한 조건으로 스핀 코팅을 수행합니다.

균일도가 높은 핫플레이트를 사용하여 포토레지스트가 코팅된 웨이퍼를 110 °C에서 2분 동안 소프트 베이크합니다. 다음으로, 마스크 얼라이너 시스템과 적절한 마스크를 사용하여 포토레지스트가 코팅된 웨이퍼에 포토 패턴을 형성합니다.

먼저, 마스크 정렬기의 진공 척 위에 기판을 놓습니다. 그런 다음 홀더 트레이에 마스크를 삽입하고 진공을 켜서 마스크를 고정함으로써 마스크와 기판 사이의 밀착 상태를 확인합니다. 기판이 마스크에 닿을 때까지 기판을 올립니다.

정렬기의 광학 장치를 사용하여 접촉이 제대로 이루어졌는지 확인하십시오. 마지막으로, 램프를 켜서 리소그래피 마스크를 통해 기판에 UV 광선을 조사합니다. 패턴이 형성된 웨이퍼를 현상액에 넣고 부드럽게 흔들어주며 1분 45초 동안 현상합니다.

반도체 등급의 탈이온수로 충분히 헹군 후, 질소 가스 스트림으로 건조하고 UV 필터가 장착된 현미경을 사용하여 패턴 현상 상태를 확인하십시오. 중량비 10:1의 수지 경화제를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. cigar 180 2 혼합물을 완전히 섞어주십시오.

일회용 페트리 접시에 담긴 혼합물로 패턴이 형성된 웨이퍼를 덮은 후, 진공 데시케이터에서 기포가 보이지 않을 때까지 PDMS로 덮인 마스터의 가스를 제거합니다. 마스터가 접시 바닥에 완전히 밀착되었는지 확인한 후, 65 °C의 오븐에서 1.5시간 동안 스탬프를 경화시킵니다. PDMS 스탬프가 경화되면, 마스터에서 스탬프를 잘라내어 적절한 크기로 다듬습니다.

먼지와 이물질로부터 보호하기 위해 스탬프의 특징부(feature side)가 위를 향하도록 덮개가 있는 용기에 보관하십시오. 금속 증착을 위한 기판을 준비하려면, 먼저 원형 유리 커버 슬립을 산소 플라즈마로 10분 동안 처리합니다. 그런 다음 커버 슬립을 탈이온수로 두 번 헹구며, 헹굼 단계 사이에는 질소 가스 스트림으로 건조시킵니다. 물로 헹군 후에는 에탄올로 다시 두 번 헹구고, 마찬가지로 헹굼 단계 사이에 질소 가스 스트림으로 건조시킵니다.

멀티 포켓 전자빔 증착 시스템을 사용하여 50 angstroms의 티타늄을 증착한 후 150 angstroms의 금을 증착하십시오. 티타늄 층과 금 층의 증착 사이에 증착기를 벤트(vent)하지 마십시오. PDMS 스탬프를 에탄올로 헹구고 완전히 건조시키십시오.

질소 가스를 사용하여, 스탬프가 완전히 코팅될 때까지 스탬핑 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 도포합니다. 질소 가스로 스탬프를 완전히 건조시킵니다. HEXA Decane 파일의 마이크로 접촉 인쇄는 PDMS 스탬프의 형상에 따라 달라지며, 이 절차에서 가장 까다로운 부분 중 하나입니다.

성공적인 스탬핑을 위해서는 균일한 압력을 가하는 숙련된 기술이 필요합니다. 스탬핑 과정 중, 공기 중에서 수행하는 일반적인 마이크로 접촉 인쇄의 경우, 스탬프를 금 기판 위에 부드럽게 누르고 단분자층이 형성될 때까지 15초 동안 유지하십시오.

또는, 매우 작은 특징과 높은 종횡비로 구성된 패턴의 경우, 금 기판을 18.2 mega Ω 탈이온수가 담긴 페트리 접시에 넣고 기판이 완전히 잠기도록 합니다. 그다음 스탬프를 금 기판 위에 가볍게 누르고 15초 동안 단분자층이 형성되도록 둡니다. 다음으로, 스탬핑된 기판을 에탄올로 두 번 헹군 후 질소 가스로 건조합니다.

각 세척 단계 후에 기질을 페트리 접시에 넣고 백필링 용액(back filling solution)으로 기질을 덮습니다. 증발을 방지하기 위해 파라필름(parafilm)으로 접시를 밀봉합니다. 어두운 곳에서 12~14시간 동안 배경 단분자층(background monolayer)이 형성되도록 둡니다.

마지막으로, 패턴 처리된 커버슬립을 후면 충진 용액에서 꺼내 에탄올로 2회 세척하고, 각 세척 단계 후에 질소 가스로 건조합니다. 패턴 처리된 커버슬립에 단백질을 도포하려면, 커버슬립을 작은 페트리 접시나 세포 배양 챔버에 넣습니다. 500 µL에서 1 mL의 DPBS(delcos phosphate buffered saline)로 덮어줍니다. 단백질 배양 동안 DPBS가 기판을 완전히 덮고 있어야 합니다.

단백질이 균일하게 도포되도록, DPBS에 고농도 단백질 용액을 첨가하고 피펫팅을 여러 번 하여 혼합합니다. 단백질 혼합액과 기질을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 기질이 마르거나 공기-물 계면(air water interface)에 노출되지 않도록 주의하면서 DPBS로 기질을 충분히 헹궈 결합하지 않은 단백질을 제거합니다.

세 번 헹군 후 DPBS를 흡입하여 제거합니다. 그 다음, 기질이 마르지 않도록 약 500 µL의 완전 세포 성장 배지를 첨가합니다. 기질을 헹구는 데 사용한 성장 배지를 교체합니다.

새 배지를 사용하여 이제 기판에 세포를 플레이팅할 준비가 되었습니다. 일반적으로 제곱밀리미터당 30~200개의 세포를 기판에 플레이팅합니다. 이 이미지는 A-P-D-M-S 스탬프의 패턴 면을 유리 커버 슬립 위에 놓아 현미경으로 관찰한 모습이며, 스케일 바는 100 micrometers입니다.

적절한 스탬핑을 수행하면 LOR 6 47로 표지된 fibronectin과 같은 형광 표지 단백질을 처리하여 시각화할 수 있는 선명하고 뚜렷한 단백질 패턴이 생성됩니다. 여기에서는 chk one 세포가 단백질 패턴 내에 국한된 모습이 나타나 있습니다. 이 이미지들의 스케일 바는 100 micrometers입니다.

또는, SU 고정 후 단백질 패턴을 시각화하기 위해 면역조직화학법을 사용할 수 있습니다. 여기서는 in vitro 4일 차의 E 18 생쥐 해마 뉴런이 파종된 패턴화된 라미닌을 시각화하기 위해 LOR 3 50 결합 항라미닌 항체를 사용하였습니다. MIT tracker red 5 80으로 염색된 E 18 생쥐 해마 뉴런은 세포 성장이 단백질 패턴 내에 잘 제한되어 있음을 보여줍니다. 이 기술은 쉽게 습득할 수 있지만, LOR 6 47 결합 피브로넥틴 흡착으로 시각화된 이러한 패턴 기질 준비물에서 볼 수 있듯이 몇 가지 일반적인 문제가 발생할 수 있습니다.

농축된 단백질 용액을 DPBS에 충분히 혼합하지 않고 단백질을 도포하면 단백질 패턴이 불균일하게 형성될 수 있습니다. 스탬핑이 부적절하게 이루어지면 패턴이 부분적으로만 전사되거나 스탬프가 무너질 수 있습니다. 또한, 단백질이 흡착된 패턴 기판을 공기에 노출시키면 단층이 파괴되어 저항이 감소할 수 있습니다.

배경 설명을 드리자면, 침지 패터닝(submerged patterning)은 기존의 공기 중 마이크로 접촉 인쇄로는 구현하기 어려운 미세한 특징을 가진 패턴을 생성할 수 있습니다. 이 두 이미지는 동일한 PDMS 스탬프를 사용하여 공기 중 또는 탈이온수 내에서 인쇄한 동일 패턴의 서로 다른 영역을 보여줍니다. 왼쪽 이미지에 표시된 지지선은 패턴의 미세한 부분만 성공적으로 인쇄되지 않았음을 입증합니다. 스케일 바는 20 micrometers입니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 18에서 24시간 이내에 완료될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 패턴 기판을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. PDMS 스탬프를 제작하십시오. 마이크로 접촉 인쇄법을 이용하여 패턴 금 기판을 준비하고, 단백질과 세포를 사용하여 이 패턴을 시각화하십시오.