Lentivirus 제작

본 절차는 lentivirus, 플라스미드 및 바이러스 패키징 벡터를 사용하여 2 9 3 T 세포를 형질전환하는 것으로 시작하며, 최소 48시간의 배양 기간 후에 바이러스 상청액을 수집합니다. 수집된 상청액은 필터링한 후 초원심분리기를 사용하여 농축합니다. 바이러스 펠렛을 PBS로 재현탁하여 바이러스 역가를 구하며, 먼저 농축된 바이러스를 완전 배지에 희석한 다음, 단계별 희석을 수행하여 lentivirus로 세포를 감염시킵니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스 당뇨병 센터의 Michael McManus 연구실 소속 Shein Wong입니다. 저는 Michael McManus입니다. 오늘은 렌티바이러스 제작 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 RNA 간섭을 위한 렌티바이러스를 제작하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 2 9 3 T 세포에 트랜스펙션할 DNA를 준비하십시오.

먼저 1.5 mL 튜브에 Fuji six transfection 시약 30 µL와 무혈청 배지 600 µL를 혼합하여 희석합니다. 시약을 배지에 넣을 때 Fuji six가 튜브 벽면에 닿지 않도록 주의하며, 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 튜브 캡에 렌티바이러스 플라스미드 4 µg과 1.33 µg을 혼합합니다.

각각의 3세대 바이러스 패키징 벡터입니다. 렌티바이러스 플라스미드는 DNA를 포함하고 있습니다. 바이러스는 감염시키는 모든 세포의 게놈에 삽입되며, 패키징 벡터는 렌티바이러스를 만드는 데 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자를 포함합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 몇 번 뒤집어 섞어줍니다.

DNA와 transfection 시약을 상온에서 15~20분 동안 배양합니다. 이제 준비된 DNA를 2 9 3 세포에 transfection할 차례입니다. 24시간 전에 플레이팅하여 조직 배양 후드 내에서 50~70%의 confluence에 도달한 세포를 사용하십시오. 준비된 모든 DNA를 2 9 3 플레이트에 피펫으로 분주하고, 플레이트를 앞뒤로 천천히 기울여 부드럽게 혼합합니다. 세포를 인큐베이터로 옮겨 수확 전까지 48~96시간 동안 바이러스 생산이 계속되도록 합니다. 배양 과정 동안 2 9 3 세포는 관심 DNA의 RNA 복사본을 게놈으로 포함하는 렌티바이러스를 생성합니다.

이제 바이러스를 수집할 차례입니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼내십시오. 조직 배양 후드 안에 0.4 또는 5 micron 시린지 필터, 일회용 10 milliliter 시린지, 그리고 UltraClear Beckman 원심분리 튜브를 준비해 두십시오.

일회용 주사기를 사용하여 바이러스가 포함된 상층액을 제거합니다. 주사기 끝에 0.45 micron 주사기 필터를 장착하고 바이러스를 UltraClear Beckman 원심분리관에 여과하여 옮깁니다. 이 필터는 세포는 걸러내고 바이러스만 통과시키며, 이후 바이러스 생성 세포를 모두 폐기하고 배양합니다.

배양 플레이트, 주사기 및 필터를 10% bleach에 45분 동안 담가 소독합니다. 바이러스를 수집하고 필터링했으므로, 이제 초원심분리를 통해 바이러스를 농축해야 합니다. serum free DMEM을 사용하여 바이러스가 포함된 모든 튜브의 무게 차이가 0.2 grams 이내가 되도록 맞춥니다.

다음으로, 균형을 맞춘 원심분리관을 SW 41 TI 또는 SW 28 로터 버킷에 넣습니다. 로터 버킷을 밀폐한 후 로터에 고정합니다. 그런 다음 로터를 초원심분리기에 넣습니다.

SW 41 TI 로터의 경우 25,000 RPM, SW 28 로터의 경우 24,000 RPM으로 4°C에서 약 90분 동안 바이러스를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 조직 배양 후드로 돌아와 튜브를 뒤집어 SNAT를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 붓습니다. Kim wipe를 사용하여 펠렛 주변의 과잉 액체를 흡수하고, 펠렛을 재부유시킬 준비가 될 때까지 편리한 랙에 튜브를 뒤집어 놓되 5분을 넘기지 않도록 합니다.

바이러스 펠렛을 재부유시키려면, 필터 팁을 사용하여 튜브에 멸균 여과된 PBS 100 microliters를 첨가하십시오. 그다음 피펫팅을 약 20회 반복합니다. 재부유가 완전히 이루어지도록 바이러스를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

바이러스 준비물은 4°C에서 약 일주일 동안, -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있습니다. 모든 빈 튜브는 폐기 전 10% 표백제로 처리해야 함을 유의하십시오. 바이러스 준비물을 일주일 이상 사용할 계획이라면 냉장고에 보관하십시오.

향후 실험을 위해 5~20 µL의 소량 분주액을 여러 개 만들고, 적정(titration)을 위해 3~5 µL의 분주액을 하나 만든 후, 분주액들을 약 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 단계는 바이러스 역가(viral titer)를 결정하는 것입니다. 렌티바이러스 플라스미드에 형광 리포터 유전자를 포함시킨 경우, 감염된 세포에서 형광이 나타나므로 유세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 바이러스 역가를 결정할 수 있습니다.

먼저, 96-웰 플레이트의 한 행에 있는 1번부터 6번 웰에 각각 1.5 milliliters의 완전 배지를 넣고, 여기에 농축된 바이러스 3 microliters를 희석합니다. 100 microliters의 완전 DM을 사용하여 6개 모든 웰에 대해 다음과 같이 연속 희석을 수행합니다. 첫 번째 웰에는 바이러스가 포함되지 않은 배지 100 microliters를 추가합니다.

이것은 염색하지 않은 대조군입니다. 두 번째 웰에는 희석된 바이러스 100 µL를 첨가합니다. 세 번째 웰에는 두 번째 웰의 혼합물 100 µL를 네 번째 웰에 첨가합니다.

세 번째 웰에서 다섯 번째 웰로 100 µL를 추가합니다. 네 번째 웰에서 여섯 번째 웰로 100 µL를 추가합니다. 다섯 번째 웰에서 100 µL를 추가합니다.

마지막으로 여섯 번째 웰에서 100 µL를 취해 폐기하고 표백 처리합니다. 그 후 모든 웰의 총 부피가 200 µL가 되도록 DMEM을 추가합니다. 희석을 거듭할 때마다 바이러스 농도는 절반으로 감소합니다. 참고로 이는 권장 희석 배수로, 대부분의 고농도 바이러스 역가 측정에 적합합니다.

바이러스의 역가가 낮거나 농축되지 않은 경우, 희석 배수를 조정해야 할 수도 있습니다. 사용하지 않고 남은 희석 바이러스는 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리기 전 10% bleach로 45분 동안 처리하십시오. 6개의 웰 각각에 건강하게 활발히 분열하는 2 9 3 T 세포 약 15, 000개를 첨가합니다.

단일 96웰 플레이트를 사용하여 16종의 바이러스 준비물을 적정할 수 있으며, 각 웰의 부피를 200 µL까지 채운 뒤 세포를 인큐베이터로 옮겨 최소 48시간 동안 감염이 진행되도록 합니다. 배양 후, 유세포 분석기를 사용하여 세포 형광을 분석합니다. 웰당 형광 세포의 백분율을 이용하여 적정가 또는 첨가된 바이러스 1 mL당 감염성 바이러스 입자 수를 결정할 수 있습니다.

유세포 분석기 결과를 해석할 때 다음 공식을 사용하여 밀리리터당 감염 단위 수를 계산하십시오. 감염된 세포당 바이러스 통합이 1회 이하로 이루어진 경우에만 정확한 역가 계산이 가능하다는 점에 유의하십시오.

이를 확실히 하기 위해, 계산 시 감염률이 15% 미만인 세포를 사용하십시오. 감염률이 더 높은 세포는 세포당 여러 개의 바이러스가 통합되었을 가능성이 큽니다. 2단계에서 제안한 희석법을 사용하면 이 감염 범위 내에 있는 여러 샘플을 얻을 수 있을 것입니다.

이상적으로는 여러 개의 샘플을 사용하여 최종 타이터를 계산할 수 있는 적정 곡선을 생성하십시오. 피팅된 직선의 계산식을 사용하여 바이러스 타이터를 산출할 수 있으나, 필요한 경우 단일 샘플을 사용하여 타이터를 계산할 수도 있습니다. 농축되지 않은 바이러스의 경우 mL당 1 × 10⁷ transducing units의 타이터를, 농축된 바이러스의 경우 mL당 1 × 10⁸ transducing units의 타이터를 기대할 수 있습니다.

지금까지 이 절차를 통한 렌티바이러스 생산 방법을 살펴보았습니다. 모든 생물 안전 규정을 준수하고 폐기물을 적절하게 처리하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.