포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

이 절차의 전반적인 목표는 렌티바이러스 패키징에 대해 배우는 것입니다. 이는 5일 과정의 프로토콜입니다. 첫째 날에는 293TN 생산 세포를 계산된 밀도로 플레이팅합니다.

둘째 날에, 관심 유전자가 포함된 선택한 렌티 벡터 컨스트럭트와 바이러스 패키징 플라스미드 믹스를 세포에 트랜스펙션합니다. 넷째 날에, PEG 바이러스 침전 용액을 첨가하여 바이러스 상청액을 수확하고 농축합니다. 이 절차의 마지막 단계는 PEG로 농축된 바이러스를 수확하고, 바이러스를 분주하며, 농축된 바이러스로 세포를 감염시켜 바이러스 타이터를 측정하는 것입니다.

최종적으로, 안정적으로 삽입된 유전자의 정량적 PCR을 통해 안정적으로 삽입된 컨스트럭트의 수를 계산합니다. 플라스미드 형질전환이나 레트로바이러스 도입과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, FBI의 최적화된 렌티바이러스 패키징 프로토콜이 고역가의 기능적 활성 바이러스를 생성한다는 점이며, 이를 통해 줄기세포나 비분열 일차 세포와 같이 형질전환이 어려운 세포를 포함하여 거의 모든 포유류 세포에 효율적인 전달이 가능합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 고역가 바이러스의 성공적인 생산에 필수적인 세부 프로토콜 사항들에 익숙하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다.

형질전환 중에 현미경으로 관찰되는 세포 밀도는 바이러스 패키징 효율을 결정하며, 이는 최종 바이러스 역가(titer)를 결정하므로 이 방법의 시각적 시연이 유용합니다. 해당되는 경우, 형광 리포터 발현을 통해 형질전환 효율을 결정할 수 있으며, 이는 최종 바이러스 역가에 상당한 영향을 미칩니다. 또한, 이 방법의 시각적 시연은 연구자가 전 과정 동안 무균 상태를 유지하기 위한 최선의 방법이나 수확한 바이러스에 세포 파편이 포함되지 않도록 하는 방법과 같이, 미묘하지만 중요한 프로토콜 단계를 익히는 데 도움이 됩니다.

효율적인 렌티바이러스 패키징은 세 가지 구성 요소에 의존합니다. 첫째, 렌티바이러스 발현 벡터는 관심 유전자의 발현을 위한 요소뿐만 아니라 바이러스 패키징과 안정적인 통합에 필요한 일부 요소를 포함해야 합니다. 여기에는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 마이크로 RNA 또는 리포터 카세트가 포함됩니다.

둘째, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 발현 컨스트럭트의 RNA 복제본을 재조합 유사 바이러스 입자로 패키징하고, 감염 후 역전사 및 바이러스 통합에 필수적인 단백질을 제공해야 합니다. 셋째, 2 9 3 TN 생산 세포에 발현 벡터와 패키징 벡터를 일시적으로 공동 형질전환시켜야 합니다. 이 세포들은 배양 배지에서 수확 가능한 고역가의 유사 바이러스 입자를 생성합니다.

결국, 표적 세포의 성공적인 형질전환은 주로 주어진 세포 유형당 바이러스 입자 수에 의해 결정됩니다. 즉, 감염다중도(multiplicity of infection)가 중요합니다. 먼저 293 TN 세포를 15 centimeter 세포 배양 플레이트에서 18~24시간 동안 배양하여 60~80%의 합쳐짐(confluency)을 얻습니다.

형질전환 시점에 각 플레이트는 바이러스 수율을 높이기 위해 약 14 million cells를 생성하게 됩니다. 다음 날 293 TN 세포가 60에서 80% 정도로 합쳐졌을(confluent) 때 형질전환 준비가 완료되며, 이때 하나 이상의 플레이트를 사용할 수 있습니다. 세포가 담긴 각 플레이트당 1.6 milliliters의 무혈청 DMEM을 15 milliliter falcon tube에 넣으십시오.

그 다음 22.5 µg의 ppac H one 또는 Ppac F1과 4.5 µg의 lenti vector Construct를 DMEM에 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 동일한 튜브에 55 µL의 pure affection을 넣고 10초 동안 볼텍싱한 후, 상온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 각 배양 플레이트에 한 튜브씩 첨가합니다.

용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 플레이트를 가볍게 흔들어 섞고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 48시간 후, 렌티벡터 컨스트럭트가 GFP와 같은 형광 유전자를 발현하는 경우 현미경으로 세포를 확인하십시오. 형질전환이 성공적이라면 50%에서 90% 이상의 세포가 녹색 형광을 띱니다. 이제 세포 배양 상층액을 50 mL 원심 분리관에 수집하십시오. 이 상층액에는 감염성 유사 바이러스 입자가 포함되어 있습니다.

플레이트에서 떨어져 나온 세포는 바이러스 생산에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 부유물을 제거하기 위해 바이러스 상층액을 상온에서 1500 G로 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 바이러스 상층액을 수집하되, 상층액 약 500 µL 정도의 여유분을 남겨두고, 트랜스펙션 72시간 후에 바이러스 입자를 농축하는 다음 단계로 진행합니다.

바이러스 상태(viral sate)를 수집한 후, 동일한 기술을 사용하여 바이러스 상층액을 선택적으로 2차 수집할 수 있습니다. 50 milliliter 폴리프로필렌 원심분리관에 상층액 4부피당 얼음처럼 차가운 peg 바이러스 침전 용액 1부피를 첨가하여 농축합니다. 용액을 뒤집어 섞어줍니다.

절대로 볼텍스(vortex)를 사용하지 말고, 용액을 흔들지 않은 상태로 4 °C에서 최대 96시간 동안 보관하십시오. 최소 12시간 동안 냉장 보관한 후, 혼합물을 4 °C에서 1500 G로 30분 동안 원심분리하십시오. 원심분리가 끝나면, peggo로 침전된 렌티바이러스 입자가 튜브 바닥에 베이지색 또는 흰색 펠렛(pellet) 형태로 나타납니다.

이제 펠렛에 침전된 렌티바이러스 입자가 흐트러지지 않도록 주의하여 흡입함으로써 모든 액체 흔적을 제거합니다. 또는 상층액의 대부분을 제거하고 남은 상층액에 펠렛을 재부유시킵니다. 그 다음, 현탁액을 멸균된 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 저온 원심분리기를 사용하여 2분 동안 원심분리합니다.

14,000 RPM에서 원심분리한 후 남은 상층액을 피펫으로 제거하고, 렌티바이러스 입자 펠렛을 원래 부피의 1/10에서 1/100 수준의 얼음처럼 차가운 멸균 버퍼에 재현탁합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫으로 펠렛을 용액에 옮기고, 항상 차갑게 유지하십시오. 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오.

마지막으로, 멸균된 냉동 보관 튜브에 15 내지 25 µL씩 분주하여 얼음 위에 두고, 튜브를 -70 °C에서 보관하십시오. 패키징 과정이 성공적이면 밀리리터당 10 million 내지 1000 million IFU가 생성되며, 이를 24-well 배양 플레이트에 well당 50,000 cells의 밀도로 분주하고 지정된 배양 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 바이러스 형질전환을 수행합니다. 역가 측정 목적의 형질전환을 위해서는 세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 50 내지 70% 사이여야 합니다.

HT 10 80 세포는 형질전환이 쉬운 대조군 세포주로 사용할 수 있습니다. 다음 날 세포에서 배지를 흡입하여 제거하십시오. 그런 다음 배양액과 농축된 duck 용액을 혼합합니다. 이때 trans duck의 최종 농도가 1x가 되도록 합니다. 표적 세포의 밀도가 50~70% 합류율(confluency)인 각 웰에 형질전환된 액체 0.5 mL를 첨가하십시오. 각 웰에 바이러스를 1:100, 1:10, 그리고 1:1 원액 희석 비율로 첨가하십시오.

배지를 교체하지 않고도 바이러스를 표적 세포와 최대 72시간 동안 접촉 상태로 유지할 수 있습니다. 72시간 후에는 프로바이러스가 숙주 게놈에 안정적으로 통합되어 목적 유전자를 발현하게 됩니다. 형광 마커 발현이 존재하는 경우 이를 통해 다양한 바이러스 희석 배율에 따른 형질도입 효율을 추정할 수 있으며, QPCR을 통해 감염성 단위 수를 정량화할 수 있습니다.

바이러스 역가를 확인한 후, 다른 표적 세포에 대해 원하는 감염 다중도(multiplicity of infection)를 달성하기 위한 적절한 바이러스 부피를 계산하십시오. 역가를 측정하고 MOI를 조절함으로써 실험 간 및 서로 다른 바이러스 조제물 간의 일관성을 보장할 수 있습니다. 이제 바이러스를 추가 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

형질전환 당일 성공적인 바이러스 패키징을 위해서는 2 9 3 TN 세포의 초기 밀도가 매우 중요했습니다. 이 2 9 3 TN 세포의 합류도는 60에서 80% 사이였습니다. GFP를 발현하는 렌티 벡터로 형질전환을 성공적으로 수행한 지 24시간 후에, 2 9 3 TN 세포의 최소 90% 이상에서 녹색 형광이 나타남을 확인했습니다.

형질도입 72시간 후에도 HT 10 80 숙주 세포에서 GFP가 계속 발현되었습니다. 이는 렌티바이러스 컨스트럭트가 숙주 게놈에 안정적으로 통합되었음을 나타냅니다. 동일한 숙주 세포를 10배 희석하여 형질도입했을 때 GFP 발현이 비례적으로 감소했습니다. 이는 바이러스 역가와 렌티바이러스 매개 유전자 발현 사이의 관계가 정비례하기 때문입니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 하루 약 1~2시간씩 5일에 걸쳐 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 기능적으로 감염성이 있는 바이러스 입자를 효율적이고 안전하게 패키징하고, 바이러스로 세포를 성공적으로 형질도입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 렌티바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, BSL 2 등급의 조직 배양 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 잊지 마십시오.

본 절차를 수행하는 동안에는 항상 실험복과 장갑을 착용해야 합니다.