에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

Drosophila melanogaster 내에서 발달 중인 기관의 재구성을 수행하기 위해, 번데기 내부에서의 빛 전파를 가장 잘 설명하는 순방향 모델을 결정해야 합니다. 먼저 흰색 전번데기를 선택하고, 번데기의 전후축이 모세관과 평행하게 놓이도록 모세관 끝에 접착합니다. 소형 모세관에 형광 염료를 채운 후 이를 번데기 케이스에 삽입합니다.

축 조절을 신중하게 수행한 후, 번데기를 360도 회전시킵니다. 다양한 각도에서 이미지를 획득합니다. 획득한 형광 투과 조명 데이터는 기관 발달을 이미징하는 데 사용할 순방향 모델을 결정하는 데 사용됩니다.

안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원 보조 생물학 센터의 Claudia입니다. 저는 하버드 의과대학 Paramount Lab의 Ula Petou입니다. 그리고 저는 뮌헨 공과대학교 및 Heliman Center Munich의 생물 및 의료 영상 연구소의 Daniel Rozanski입니다. 오늘은 Oph Melano Casta의 전신 3차원 재구성 절차를 보여드리겠습니다.

저희 연구실에서는 동공 상태 동안 기관의 발달을 in vivo로 시각화하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 시작하기 전에, 광학 투사 단층 촬영(optical projection tomography)의 일부 기술적 측면이 여기보다 더 자세히 설명된, 이 영상 이전에 시청해야 할 동반 영상이 없음을 참고하시기 바랍니다.

또한, 다른 영상에서는 더 큰 동물의 준비된 조직 또는 장기 영상을 촬영하는 방법을 설명합니다. 이 영상에서 다루는 모든 실험에는 초파리 트랜스젠이 사용됩니다. 이들은 침샘에서 발현되는 EL A gal four, 성체 날개와 흉부의 유충 전구 조직에서 발현되는 apteris gal four, 그리고 형광 단백질을 생성하는 트랜스젠입니다.

U-A-S-G-F-P 및 white 1118의 gal four 반응에 따라, UAS 트랜스진을 보유한 비형광 대조군 수컷을 GAL four 트랜스진을 보유한 처녀 암컷과 교배하여 조직 특이적 GFP 발현을 유도합니다. GFP 교배는 8~10마리의 처녀 암컷과 수컷을 베이커 효모가 소량 첨가된 표준 초파리 배지에 넣어 설정합니다. 배양 병은 습도가 조절되는 인큐베이터 내에서 25 °C, 12시간 명암 주기 조건으로 보관합니다.

교배를 시작하고 이틀 후, 부모 개체들을 새 바이알로 옮기며, 5~6일 후에 PUI가 PrepU가 있는 바이알에 서식하기 시작할 것입니다. 형광 해부 현미경 하에서 GFP 발현 여부에 따라 선택합니다. 흰색의 pre pui를 선택함으로써 동물이 약 한 시간 동안 흰색을 유지하므로, 개체들의 단계(staging)를 정확하게 확인할 수 있습니다.

동공 형성 후, 이들은 색소 침착이 일어나거나 갈색으로 변합니다. GFP를 발현하는 pupae를 젖은 붓을 사용하여 바이알에서 조심스럽게 수집한 다음, 페트리 접시의 물 한 방울 또는 PBS에 넣으며, 이때 자동형광 물질이 묻어 있지 않도록 깨끗이 닦아내야 합니다. 붓을 사용하여 위치를 잡으면, 이제 토모그래피 이미징을 위한 준비가 완료됩니다.

PrepU를 적절한 발달 단계까지 계속 성숙시켜야 하는 경우, 젖은 종이 타월이 들어있는 페트리 접시나 깨끗한 식품 보관 병(food vial)에 보관할 수 있습니다. 이를 통해 영상 촬영을 위한 충분한 습도와 적절한 발달 상태를 보장할 수 있습니다. PrepU는 직경 800 micron의 유리 모세관 내벽에 부착시켜야 합니다.

번데기의 후단에 순간접착제를 바르고, 접착제가 발린 전번데기 표면이 튜브 내부를 향하도록 하여 파리의 전후축이 튜브와 평행하게 배치합니다. 동물의 전단부는 모세관 튜브 밖으로 돌출됩니다. 이제 모세관 튜브를 현미경의 회전 스테이지에 고정합니다.

수직 상태에서, 튜브의 회전축이 이미징 CCD의 픽셀 열과 평행하도록 회전 스테이지의 틸팅 축을 조정합니다. 초파리의 위치를 미세 조정하여 이미징을 진행합니다. 본 예시에서는 형광성 타액샘을 가진 동물을 이미징하며, 타액샘에서 GFP를 발현하는 초파리는 EAG four와 U-A-S-G-F-P 계통 간의 교배를 통해 생성할 수 있습니다.

고정된 전번데기에서 시작하여, 들뜸 빔으로 전번데기를 조사하고 GFP 형광 신호를 수집합니다. 투과 조명 단계에서는 전번데기를 수직축을 따라 360도 회전시키며 투과 조명 이미지를 획득합니다. 각 이미지는 10도의 회전 각도에 해당합니다.

총 획득 시간은 형광의 양과 여기 빔의 강도에 따라 달라집니다. 일반적인 소요 시간은 약 1분 정도입니다. 본 예시에서는 날개 성충판(wing imaginal discs)에서 GFP를 발현하는 DSO 번데기를 촬영하겠습니다.

이 번데기는 Aus GAL four와 U-A-S-G-F-P 계통 간의 교배 결과물인 바이알에서 수집할 수 있습니다. 전번데기는 이전에 설명한 방식대로 고정합니다. 다만, 본 실험의 이미징 시간은 약 8시간이 소요되므로, 환경이 습윤하게 유지되고 상온 상태를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 동물의 탈수와 사망을 방지하기 위해, 관심 조직 내 형광의 소멸을 막고 레이저 빔에 의해 동물이 손상되는 것을 방지하도록 여기 excitation beam 위에 셔터를 배치합니다. 이전과 마찬가지로 excitation beam으로 조명하고 투과 조명을 통해 GFP 형광 신호를 수집하십시오.

전번데기를 수직축을 따라 완전히 회전시킵니다. 데이터 수집 과정에서 회전에는 1분밖에 소요되지 않으며, 서로 다른 시간 간격으로 반복 수행합니다. 발달 과정 중 날개의 타임랩스 이미지 시리즈를 생성하려면, 시간당 100장의 속도로 최소 6시간 동안 데이터를 획득할 수 있습니다.

손상이나 광퇴색을 방지하기 위해서는 이 셔터를 통해 총 광노출량을 조절하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상은 PrepU 단계와 동공 머리 회피 반응 사이에 획득한 이미지들을 보여줍니다. 3차원 이미지를 재구성할 때, 확산으로는 근사화할 수 없으므로 반드시 고려해야 하는 강한 전방 산란이 발생합니다.

따라서 재구성을 수행하기 위해 빛 전파의 전방 산란 모델을 결정해야 합니다. 단순화를 위해 흡수는 무시합니다. 산란 정도는 실험적으로 테스트합니다. 이를 위해 표준화된 형광을 가진 이물질을 형광이 없는 흰색 1118 전용각(pre pupa)에 삽입한 후, 이를 스캔하여 전방 모델 데이터를 생성합니다. 먼저 100 micron 실리카 모세관에 PS 5.5 형광 염료를 채우는 것으로 시작하십시오.

모세관 현상을 이용하여, 전축(anterior axis)에 대해 45도 각도로 모세관을 번데기 내로 밀어 넣고, 앞서 설명한 바와 같이 PrepU를 모세관에 장착하여 회전 스테이지 위에 적절하게 배치합니다. 이제 저개구수 렌즈를 통해 여기 레이저 빔으로 전번데기(pre pupa)를 조사하고, 전번데기의 형광 투과 조명 이미지를 수집합니다. 앞서 설명한 바와 같이, MATLAB 소프트웨어를 사용하여 데이터를 명시적 이론적 순방향 모델에 피팅합니다. 재구성 과정을 용이하게 하기 위해, 순방향 산란 영역을 설명하며 실험 데이터와도 일치하는 수송 방정식의 확산 근사(diffusion approximation)를 선택합니다.

정확한 정방향 모델(forward model)을 결정한 후, 타액선을 재구성하여 시계열 단층 촬영 재구성 영상을 얻을 수 있습니다. 자유 공간 단층 촬영(free space tomography)을 사용할 계획이라면, 굴절률 매칭을 위한 구성 알고리즘 또한 설정할 수 있습니다. 먼저, 발달 초기 단계의 타액선 3D 재구성 영상을 보여드리겠습니다.

비교를 위해 타액선의 조직학적 염색을 실시한 결과, 재구성된 영상이 조직학적 소견과 잘 일치함을 확인할 수 있습니다. 날개 성체원판의 발달 과정을 담은 이 타임랩스 영상은 단일 생체 표본으로부터 얻은 것입니다. 동일한 시점에서의 날개 원판 조직학적 염색 결과와 비교했을 때, 재구성된 영상이 조직학적 소견과 잘 일치함을 보여줍니다.

지금까지 Drosophila 생체 내(in vivo)에서 3차원 구조를 시간에 따라 이미징하는 시스템을 구축하는 방법을 보여드렸습니다. 이를 통해 Drosophila의 형태 형성을 추적하고, 6시간 연속으로 날개의 발달 과정을 관찰할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 Drosophila 내 빛 전파에 적합한 순방향 모델(forward model)을 선택하는 것이 매우 중요합니다.

이 방법은 조직학적 기법과 병행하여 oph pupil 단계 동안의 기관 발달을 규명하는 데 활용될 수 있으며, 비슷한 크기의 다른 생물체 연구를 위해 수정하여 적용할 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.